Name: 冷冻组织切片中转录组和表观基因组靶点的空间分辨、集成多组分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-06-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习空间多组学工作流程，通过空间条形码与单细胞分析技术，在冷冻脑组织切片中同时分析H3K27ac组蛋白修饰和基因表达。该方法将表观基因组与转录组数据整合到相同细胞核，实现精确的细胞类型注释，揭示空间调控程序与细胞间相互作用，为神经科学研究提供高分辨率的分子图谱。

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本工作部分得到了美国国立卫生研究院基金R01 DK142826（T.O.）、R01 DK121766（Y.H.）、R01 DK126827（T.O.）、R01 DK131455（T.O.；MPI）、P30 DK084567（T.O.：表观基因组学与空间生物学核心，梅奥诊所胃肠道细胞信号研究中心）以及梅奥诊所总统战略倡议基金（T.O.）的支持。资助机构在研究设计、数据分析或稿件撰写过程中未发挥任何作用。本文内容仅由作者负责。

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作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学工作流程，该流程整合了空间条形码技术、低起始量的H3K27ac CUT&amp;#38;Tag分析、在10x Genomics单细胞多组学凝胶珠上同时捕获多个分子靶标，以及后续用于Illumina测序的文库构建。通过将空间索引与单细胞表观基因组和转录组读数相结合，该方法解决了传统单细胞多组学检测中缺乏天然组织背景这一根本性局限。本研究成功证明了空间CUT&amp;#38;Tag多组学联合分析（H3K27ac CUT&amp;#38;Tag与基因表达）的可行性，并为基因表达与调控靶标（如组蛋白修饰和染色质相关蛋白）的空间共分析奠定了基础。
在整个工作流程的多个阶段实施严格的质控，对于成功执行该工作流程至关重要（图1）。尽管本文所述操作从切片后的步骤开始，但组织切片本身的质量对获得最佳结果极为关键。切片厚度应根据组织类型和预期细胞密度进行调整。在组织解离和细胞核分离过程中，最大限度地提高细胞核得率，同时保持细胞核完整性，对于基于Trekker的单细胞多组学检测的整体性能至关重要。细胞核得率偏低可能源于组织解离不充分、细胞核分离效率低下或切片过薄。细胞核完整性差可能由过度机械破坏、处理时间过长或过度裂解所致。细胞核分离是成功实施基于Trekker的单细胞多组学工作流程中的一个主要排查环节。因此，强烈建议在启动基于Trekker的单细胞多组学检测前，针对特定组织优化细胞核分离方案。分离得到的细胞核应进行定量和定性评估。使用细胞核染料进行计数可估算得率，而显微镜检查则可用于评估细胞核膜完整性、聚集情况以及非细胞核碎片的存在。文库构建完成后，应对所有文库检测片段大小分布及是否存在接头二聚体。对于CUT&amp;#38;Tag文库，应通过定量PCR评估目标基因组区域相对于背景的富集程度，从而在测序前初步判断检测的特异性和文库整体质量。测序后的质量控制对于准确解读空间多组学数据同样重要。应依据10x Genomics和Takara&#160;Trekker的推荐指南，评估诸如比对率、每个细胞核的片段数、转录起始位点富集度、CUT&amp;#38;Tag的峰内片段得分、基因复杂度以及每个细胞的测序深度等指标。对表观基因组和转录组两种模态数据的这些指标进行联合评估，有助于识别技术性假象，并确保空间、表观遗传和转录信息的可靠整合。
尽管本研究证明了基于Trekker的条形码标记方法结合单细胞CUT&amp;#38;Tag多组学检测的可行性，但该方法也存在局限性。例如，该技术目前仅限于新鲜冷冻组织，且仅在单一组织类型（小鼠脑组织）中针对单一组蛋白修饰（H3K27ac）进行了验证，尚未设置生物学重复。此外，该方法依赖于两个专有的商业化平台（Takara&#160;Trekker 和 10x Genomics Next GEM Chromium Single Cell Multiome）。为了全面评估该技术的适用范围、性能、普适性及可重复性，还需在多种组织类型中对更多表观遗传标记进行进一步验证。
综上所述，本文介绍的空间 Trekker–CUT&amp;#38;Tag 多组学方案展示了对表观基因组和转录组特征进行空间分辨单细胞共分析的能力。该方法通过将空间条形码技术与成熟的单细胞多组学化学反应相结合，能够在完整组织结构中开展基因调控机制的研究，为未来空间生物学应用提供了一个强大的平台。其潜在的重要应用包括评估各种实验和环境刺激对特定细胞类型中基因表达表观遗传调控的影响——例如，可在中枢和外周神经系统中的特定神经元类型中分析神经刺激的作用，或在炎症性疾病和癌症中揭示浸润性促炎和抗炎免疫细胞对邻近细胞的影响。

空间生物学是一个快速发展的领域，旨在绘制分子、细胞和组织在其原生环境中的位置、结构及相互作用1,2,3。与需要组织解离并导致位置信息丢失的整体或传统单细胞方法不同，空间分析技术能够保留分析物或细胞/细胞核的物理坐标，从而直接研究组织结构如何影响细胞身份、细胞间通讯以及生物学功能4,5,6,7。尽管目前空间转录组学和空间蛋白质组学是应用最广泛的技术，但该领域正迅速向空间多组学分析扩展3,8,9。在同一组织中联合分析基因表达与表观基因组状态尤其具有强大优势，因为它能将转录输出直接与调控机制（如染色质可及性和组蛋白修饰）联系起来，而这些机制控制着基因活性，并且已知在不同空间区域中存在差异10,11,12。因此，整合的空间表观基因组与转录组分析将为调控程序如何塑造细胞身份和组织结构提供关键见解。
目前已开发出多种空间多组学策略，以实现表观基因组和转录组的同步分析。组织测序中的确定性条形码技术（DBiT-seq）利用微流控通道将空间条形码直接递送至组织切片，或通过凝胶板印迹间接递送，从而实现对分析物的空间注释。该方法支持表观基因组和转录组特征的空间分辨共分析12,13,14,15。Slide-tag方法（已作为Takara Trekker平台商业化）在组织解离前直接将空间条形码引入完整组织中，使得具有空间索引的细胞核可采用标准单细胞流程进行处理，并通过计算方法回溯至其原始组织坐标16。相比之下，结合测序技术的空间可及染色质、细胞谱系与基因表达分析方法（SPACE-seq）采用“靶向外”策略，即在空间转录组芯片上的poly-dT捕获序列上同时捕获带有poly(A)尾的表观遗传靶标和mRNA17。
靶位点切割与标签化（Cleavage under targets &amp; tagmentation，CUT&amp;Tag）是一种强大的技术，可用于从极低起始量的样本中绘制DNA与组蛋白或非组蛋白之间相互作用的图谱18。CUT&amp;Tag依赖于Tn5转座酶介导的染色质片段化和DNA标签化（即“标签化切割”，tagmentation），利用抗体引导的、蛋白A偶联的Tn5转座酶实现位点特异性的切割和分子标记。尽管传统的CUT&amp;Tag实验包含多个孵育和洗涤步骤，但本研究采用了一种简化且流程优化的CUT&amp;Tag工作流程，以提高其在下游单细胞多组学应用中的效率19。
<img alt="空间 CUT&amp;Tag：H3K27ac 工作流程图、DNA 条形码、细胞核分离、基因文库制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71046/71046fig1.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图 1"> 
图 1：空间 Trekker–CUT&amp;Tag 多组学检测的工作流程与质量控制概览。(A) 空间 Trekker–CUT&amp;Tag 多组学工作流程示意图。将新鲜冷冻的小鼠脑组织冠状切片固定在 Trekker 空间芯片上，并进行空间条形码标记。组织裂解后，分离细胞核并评估其产量与质量。取约 50,000 个细胞核用于 H3K27ac CUT&amp;Tag 反应，经标签化（tagmented）的细胞核在计数后通过 10x Genomics Chromium 多组学凝胶珠进行单细胞条形码标记。单细胞条形码化的 DNA 经预扩增后分为两部分。CUT&amp;Tag 文库通过加索引引物的 PCR 直接生成；而对于基因表达文库和空间条形码文库，预扩增后的 DNA 需进一步扩增并进行片段大小筛选。其中，具有典型 cDNA 大小的片段用于构建基因表达文库，较短的 DNA 片段则用于构建空间条形码文库。文库构建完成后，依据 10x Genomics 和 Curio Trekker 的指南进行测序与比对。左侧显示了预期的实验时间线。(B) 工作流程中关键的质量控制（QC）节点及重要注意事项。细胞核的质量控制包括对产量、完整性、聚集情况和碎片含量的评估；测序前的质量控制则包括对所有文库的 DNA 片段大小分布及引物二聚体污染的检测。CUT&amp;Tag 文库的特异性通过定量 PCR（qPCR）进行评估，检测目标基因组区域相对于背景信号的富集程度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71046/71046fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
本研究介绍了一种空间 Trekker CUT&amp;Tag 多组学检测方法，可同时对新鲜冷冻组织切片中与活性顺式调控元件相关的组蛋白 H3K27ac 修饰及基因表达进行分析。本方案提供了 Takara Trekker 空间条形码标记、组织解离与细胞核分离、细胞核计数与质量控制、低起始量 CUT&amp;Tag 检测 H3K27ac 修饰、10x Genomics 单细胞多组学凝胶珠对分子靶标的捕获以及文库构建的逐步操作流程。该工作流程以小鼠脑组织的冠状切片为例进行了验证。与标准的 10x Genomics 多组学流程（通过高通量测序检测转座酶可及染色质（ATAC-seq）来测量染色质可及性）不同，本方案使用 CUT&amp;Tag 来源的 DNA 片段替代 ATAC 片段，从而实现对组蛋白修饰图谱的单细胞分辨率直接分析。为将 Trekker 空间条形码与 10x Genomics 单细胞条形码关联，多组学凝胶珠上的 poly-dT 序列同时捕获带 poly(A) 尾的空间条形码和 mRNA 转录本，而 CUT&amp;Tag DNA 片段则由间隔序列捕获。这种双重捕获策略使得从同一单个细胞核中可同时获取表观基因组、转录组和空间信息。据我们所知，这是首个将 Trekker 空间注释中的条形码直接整合到单细胞多组学检测中的空间多组学工作流程，可共同分析组蛋白标记的全基因组分布与转录组。所获得的具有空间分辨率的多组学图谱，整合了 H3K27ac 占有度与基因表达数据，能够将单细胞分析结果回溯至其原始组织坐标，从而在完整组织结构背景下，建立表观基因组调控机制与转录程序之间的直接关联。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>由 4% 台盼蓝溶液（Invitrogen，T10282）稀释而成</td></tr><tr><td>10% 吐温 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>10X Genomics Chromium X 仪器</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>1000331</td><td>RRID:SCR_024537</td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Thermo Fisher</td><td>150200</td><td></td></tr><tr><td>1X CUT&amp;Tag 细胞核缓冲液&amp;nbsp;</td><td>10x Genomics</td><td>制备自 20X 细胞核缓冲液</td><td>配制总体积为 110 &amp;micro;L 的溶液，混合 5.5 &amp;micro;L 20X 细胞核缓冲液（10X Genomics）+ 8.25 &amp;micro;L RNase 抑制剂 + 1.1 &amp;micro;L 100 mM DTT + 95.15 &amp;micro;L 无核酸酶水&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>20X 细胞核缓冲液</td><td>10x Genomics</td><td>2000207</td><td></td></tr><tr><td>4% 台盼蓝溶液</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>5200 片段分析仪</td><td>Advanced Analytical</td><td>M5310AA</td><td></td></tr><tr><td>ABC 图谱&amp;nbsp;</td><td>开源&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>开发者：艾伦脑科学研究所（西雅图，华盛顿州）&lt;br/&gt; RRID:SCR_024440</td></tr><tr><td>激活剂</td><td>Epigenome Technology</td><td>CF1006</td><td></td></tr><tr><td>接头连接混合液&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>由连接缓冲液、酶和寡核苷酸制备</td><td>配制总体积为 50 µL 的接头连接混合液，混合 20 µL 连接缓冲液 + 10 µL DNA 连接酶 + 20 µL 接头寡核苷酸&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>接头寡核苷酸</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000094</td><td></td></tr><tr><td>扩增混合液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000047</td><td></td></tr><tr><td>Amulet&amp;nbsp;</td><td>开源&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>开发者：Ucar 实验室（杰克逊实验室）&lt;br/&gt; RRID: N/A</td></tr><tr><td>抗 H3K27ac 抗体</td><td>EpiCypher</td><td>13-0059</td><td>该抗体批次已验证适用于批量及原位 CUT&amp;Tag 检测&lt;br/&gt; RRID:AB_3712075</td></tr><tr><td>ATAC 缓冲液 B&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>PN-2000193</td><td></td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>cDNA 扩增反应混合液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>由预扩增混合液和引物 2 制备</td><td>配制总体积为 65 µL 的 cDNA 扩增混合液，混合 50 µL 扩增混合液 + 15 µL 特征 cDNA 引物 2</td></tr><tr><td>Cell Ranger Arc v2.0.2&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>RRID:SCR_023897</td></tr><tr><td>CFX Opus 实时荧光定量 PCR 系统&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad&amp;nbsp;</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 芯片 J&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>PN 2000264</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞多组学凝胶珠试剂盒</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>PN-1000231</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM 单细胞多组学 GEM 试剂盒</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>PN-1000232</td><td>该试剂盒包含以下组分：条形码试剂混合液、条形码酶混合液、模板转换寡核苷酸、还原剂 B、清洗缓冲液和淬灭剂</td></tr><tr><td>Chromium 回收试剂</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>220016</td><td></td></tr><tr><td>清洗缓冲液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000088</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>Leica Biosystem</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>DNA 连接酶</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>220110</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 1.5 mL 管</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>双索引 TT 集合 A&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>PN-3000431</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&amp;trade; MyOne&amp;trade; SILANE（用于制备 Dynabeads 清洗混合液）</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>PN-2000048</td><td>配制总体积为 200 µL 的 Dynabeads 清洗混合液，混合 182 µL 清洗缓冲液 + 13 µL Dynabeads Myone SILANE + 5 µL 还原剂 B</td></tr><tr><td>洗脱液 I</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>由 Buffer EB 制备</td><td>配制总体积为 100 µL 的洗脱液 I，混合 98 µL Buffer EB + 1 µL 10% 吐温 20 + 1 µL 还原剂 B&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>特征 cDNA 引物 2</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000097</td><td></td></tr><tr><td>片段化缓冲液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000091</td><td></td></tr><tr><td>片段化酶</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000090</td><td></td></tr><tr><td>片段化混合液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>由片段化缓冲液和酶制备</td><td>配制总体积为 15 µL 的片段化混合液，混合 5 µL 片段化缓冲液 + 10 µL 片段化酶</td></tr><tr><td>垫圈，6 件装</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>370017</td><td></td></tr><tr><td>GEM 主混合液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>PN-1000232</td><td>来自 Chromium Next GEM 单细胞多组学 GEM 试剂盒（PN-1000232）。配制总体积为 60 &amp;micro;L 的 GEM 主混合液，混合 49.5 &amp;micro;L 条形码试剂混合液 + 1.1 &amp;micro;L 模板转换寡核苷酸 + 1.9 &amp;micro;L 还原剂 B&amp;nbsp; + 7.5 &amp;micro;L 条形码酶混合液</td></tr><tr><td>GEM-X 单细胞 3' 特征条形码试剂盒</td><td>&amp;nbsp;10X Genomics</td><td>PN 2000047</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 NGS 片段分析试剂盒</td><td>Advanced Analytical</td><td>DNF-474</td><td></td></tr><tr><td>孵育缓冲液</td><td>Epigenome Technology</td><td>CF1001</td><td>配制总体积为 100 &amp;micro;L 的 CUT&amp;Tag 孵育缓冲液 I，混合 90.5 &amp;micro;L 孵育缓冲液（CF1001，Epigenome Technology）+ 1.5 &amp;micro;L 通透剂 + 0.5 &amp;micro;L 稳定剂 + 7.5 &amp;micro;L RNase 抑制剂</td></tr><tr><td>Invent Minute 缓冲液 A&amp;nbsp;</td><td>Invent Biotechnologies, Inc</td><td>BN-020</td><td>来自 Minute 单核分离试剂盒&amp;nbsp;（货号 BN-020）。配制总体积为 800 &amp;micro;L 的 Minute 缓冲液 A，混合 786.4 &amp;micro;L Minute 缓冲液 A + 13.6 &amp;micro;L RNase 抑制剂（Takara Bio）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Invent Minute 缓冲液 B&amp;nbsp;</td><td>Invent Biotechnologies, Inc</td><td>BN-020</td><td>来自 Minute 单核分离试剂盒&amp;nbsp;（货号 BN-020）</td></tr><tr><td>KEYENCE 荧光显微镜&amp;nbsp;</td><td>KEYENCE CORPORATION</td><td>BZ-X810</td><td>RRID:SCR_025160</td></tr><tr><td>连接缓冲液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000092</td><td></td></tr><tr><td>低 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，0.1 mM EDTA）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Minute 过滤柱/收集管</td><td>Invent Biotechnologies, Inc</td><td>BN-020</td><td>来自 Minute 单核分离试剂盒&amp;nbsp;（货号 BN-020）</td></tr><tr><td>神经组织/细胞 Minute 单核分离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Invent Biotechnologies, Inc</td><td>BN-020</td><td>该试剂盒包含以下组分：Minute 缓冲液 A、Minute 缓冲液 B、Minute 过滤柱/收集管</td></tr><tr><td>Nexcelom Cellometer K2&amp;nbsp;</td><td>Revvity</td><td>CMT-K2-MX-150&amp;nbsp;</td><td>RRID:SCR_025529</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度（OCT）包埋剂</td><td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>分区油&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000190</td><td></td></tr><tr><td>通透剂</td><td>Epigenome Technology</td><td>CR1003</td><td></td></tr><tr><td>预扩增混合液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000270</td><td></td></tr><tr><td>预扩增引物</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000271</td><td></td></tr><tr><td>预扩增混合液&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>由预扩增混合液和引物制备</td><td>配制总体积为 54 µL 的预扩增混合液，混合 50 µL 预扩增混合液 + 4 µL 预扩增引物</td></tr><tr><td>淬灭缓冲液</td><td>Epigenome Technology</td><td>CF1007</td><td></td></tr><tr><td>淬灭剂</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>PN-2000269)</td><td></td></tr><tr><td>还原剂 B&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000087</td><td></td></tr><tr><td>CUT&amp;Tag 文库样本索引 PCR 混合液&amp;nbsp;</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>由预扩增混合液、SI-PCR 引物 B 和索引 N 制备</td><td>配制总体积为 60 µL 的样本索引 PCR 混合液，混合 50 µL 预扩增混合液 + 7.5 µL SI-PCR 引物 B + 2.5 µL &amp;nbsp;个体样本索引 N，集合 A（PN-3000427）</td></tr><tr><td>空间条形码文库的样本索引 PCR 混合液</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>由预扩增混合液和索引板 TT 集合 A 制备</td><td>配制总体积为 75 µL 的样本索引 PCR 混合液，混合 50 µL 扩增混合液 + 25 µL Buffer EB + 1 &amp;mu;L 扩增条形码 DNA + 20 &amp;mu;L 双索引板 TT 集合 A（PN-3000431）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>样本索引板 N，集合 A</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>3000427</td><td></td></tr><tr><td>scDblFinder</td><td>开源&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>开发者：Germain 实验室（苏黎世联邦理工学院/苏黎世大学）&lt;br/&gt; RRID:SCR_022700</td></tr><tr><td>Seurat</td><td>开源&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>开发者：Satija 实验室（纽约基因组中心）&lt;br/&gt; RRID:SCR_016341</td></tr><tr><td>SI-PCR 引物 B</td><td>10X Genomics&amp;nbsp;</td><td>2000128</td><td></td></tr><tr><td>Signac</td><td>开源</td><td>N/A</td><td>开发者：Satija 实验室（纽约基因组中心）&lt;br/&gt; RRID:SCR_021158</td></tr><tr><td>SPRIselect 试剂盒，顺磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced&amp;trade; Universal SYBR&amp;reg; Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725271</td><td></td></tr><tr><td>稳定剂</td><td>Epigenome Technology</td><td>CR1005</td><td></td></tr><tr><td>T100 热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>TAG 酶</td><td>Epigenome Technology</td><td>CR1018</td><td></td></tr><tr><td>Trekker 10x10 O 型环</td><td>Takara Bio</td><td>LC036</td><td></td></tr><tr><td>Trekker 10x10 试剂袋</td><td>Takara Bio</td><td>K009</td><td>RNase 抑制剂</td></tr><tr><td>Trekker 10x10 瓷片遮蔽贴</td><td>Takara Bio</td><td>LC023</td><td></td></tr><tr><td>Trekker 10x10 洗涤槽</td><td>Takara Bio</td><td>RC002</td><td></td></tr><tr><td>Trekker 缓冲液 C（1 X PBS 含 5% BSA）</td><td>Takara Bio</td><td>K008</td><td>来自试剂盒 1（货号 K008）。配制总体积为 300 &amp;micro;L&amp;nbsp; 的 Trekker 缓冲液 C，混合 245.7 &amp;micro;L 1X PBS + 50 &amp;micro;L 30% BSA + 4.3 &amp;micro;L RNase 抑制剂（Takara Bio）</td></tr><tr><td>Trekker 核洗缓冲液</td><td>Takara Bio</td><td>K008</td><td>来自试剂盒 1（货号 K008）</td></tr><tr><td>Trekker 分析流程 v1.3.0&amp;nbsp;</td><td>Curio Bioscience</td><td>N/A</td><td>开发者：Ucar 实验室（杰克逊实验室）&lt;br/&gt; RRID: N/A</td></tr><tr><td>Trekker 试剂盒 1</td><td>Takara Bio</td><td>K008</td><td>试剂盒 1 包含以下组分：核分离缓冲液、核洗缓冲液、BSA</td></tr><tr><td>Trekker 初学者套件捆绑包（紫外灯）</td><td>Takara Bio</td><td>K011A</td><td></td></tr><tr><td>Trekker U 10x10 瓷片</td><td>Takara Bio</td><td>UP008</td><td></td></tr><tr><td>Trekker UV 裂解缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Takara Bio</td><td>K008</td><td>配制总体积为 36 &amp;micro;L 的 UV 裂解缓冲液，混合 27 &amp;micro;L 核洗缓冲液（盒 1）+ 9 &amp;micro;L 0.4% 台盼蓝&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ViaStain AOPI 染色液</td><td>Revvity</td><td>CS2-0106</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;自定义引物序列&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>5'-CCCGGCAAGCCGAATAGGCA-3'</td><td>H3K27ac 阳性</td><td>Ch-mActb-F</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCAGACGCTACGATCACGCC-3'</td><td></td><td>Ch-mActb-R</td><td></td></tr><tr><td>5'-GAGACGCCGATCCGCCGAAG-3'</td><td>H3K27ac 阴性</td><td>Ch-mT1-F</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACTCTCCACTCCCACGCGCT-3'</td><td></td><td>Ch-mT1-R</td><td></td></tr><tr><td>5'-CCTGCTGCCTTGTCTCTCTC -3'</td><td>H3K27ac 阴性</td><td>Ch-mInter-neg-F</td><td></td></tr><tr><td>5'-ATGGCCTAGGGATTCCAGCA -3'</td><td></td><td>Ch-mInter-neg-R</td><td></td></tr></tbody></table>

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

Spatially Resolved, Integrated Single-Cell Multiomic Profiling of the Transcriptome and Epigenomic Targets in Frozen Tissue Sections

空间多组学技术与单细胞分析相结合，为揭示复杂组织的分子与细胞结构提供了前所未有的机遇。将基于包埋于最佳切割温度（OCT）冷冻介质的组织块制备的冷冻切片中细胞核进行空间条形码标记，与单细胞多组学检测相结合，形成一种简便高效的实验流程，有助于对各类组织中的细胞进行注释及空间分辨的分子分析。本研究报道了一种靶向切割下的空间分析方法 &amp;#38; 片段化（CUT&amp;#38;Tag) 多组学方法，可在单个冷冻脑切片中同时分析组蛋白H3K27ac修饰和基因表达。在完成空间条形码标记后，分离单个细胞核并进行CUT&amp;#38;Tag，结合标签化DNA、RNA和空间条形码的联合捕获、文库构建及测序。该工作流程可从同一细胞核中生成带有空间注释的表观基因组和转录组谱，实现将多组学信息定位至组织解剖坐标。整合表观基因组信息与空间转录组数据可提高细胞类型鉴定的准确性，并揭示完整组织中具有空间特异性的调控程序及细胞间相互作用。

使用新鲜冷冻的小鼠脑组织冠状切片（厚度为 25 µm，覆盖约 10 × 10 mm 空间区域的 70%），本文所述的工作流程稳定获得了 50,100 个高质量细胞核（标准差 = 12,200，n = 8），足以用于后续的单细胞多组学分析（图 1）。在对组织切片进行 Trekker 空间条形码标记后，通过温和的组织解离方法分离细胞核，并使用 Invent 单细胞核提取试剂盒进一步纯化。该过程产生的碎片极少，细胞核聚集程度低，所得细胞核样品适用于单细胞检测。分离得到的细胞核代表性图像见图 2。
对于后续的单细胞核分析，包括CUT&amp;Tag多组学检测（CUT&amp;Tag + 基因表达），通常在此处理约50,000个细胞核。为了最大化细胞核回收率，采用了一种简化且高效的低起始量CUT&amp;Tag方案，通过直接使用抗体–pA/Tn5靶向结合与标签化反应，从而最大限度地缩短孵育时间和洗涤步骤19。采用该方法，可回收约25,000个完成标签化反应的细胞核，平均回收率为48.3%（标准差 = 6.1，n = 3）。这些细胞核随后用于10x Genomics Chromium多组学凝胶珠进行单细胞条形码标记。在GEM生成过程中，目标输入约为15,000个细胞核，预计经过质量过滤后可回收约10,000个具有空间索引的细胞核。根据Trekker空间条形码解码结果，在单细胞数据集中，81.3%的细胞核（标准差 = 9，n = 3）可被明确分配至芯片内的空间位置。
空间Trekker–CUT&amp;Tag多组学工作流程生成三个带索引的文库：CUT&amp;Tag文库、基因表达文库和空间条形码文库。预扩增的条形码DNA被分为两部分，每部分根据凝胶微珠上靶标的捕获化学方法用于文库构建。CUT&amp;Tag文库直接从预扩增DNA中扩增获得，其片段大小分布呈现CUT&amp;Tag标签化反应的典型特征，对应无核小体和含核小体的DNA区域（图3A）。该文库在H3K27ac阳性Actb位点上的富集效果良好，显著高于H3K27ac阴性基因组位点20,21（即68倍差异，超过此前染色质免疫沉淀测序分析H3K27ac所确立的10倍截断值20）（图3B）。对于基因表达文库和空间条形码文库，预扩增DNA首先按照10x Genomics的cDNA扩增方案进行扩增，随后通过磁性微珠纯化根据片段大小分离为两部分。带索引的空间条形码文库由富含较短片段的部分构建而成，在预期片段大小处呈现明显的尖锐峰。基因表达文库则显示出以扩增后cDNA片段为中心的典型大小分布（图3A）。
<img alt="UMAP 降维图；H3K27ac CUT&amp;Tag 分析、基因表达、空间核图谱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/71046/71046fig4.jpg" data-altupdatedat="1787025648000" data-alt="图 4"> 
图 4：空间 Trekker–CUT&amp;Tag 多组学检测在小鼠脑组织中的单细胞和空间表征。（A）通过单细胞分析鉴定细胞类型。均匀流形近似与投影（UMAP）图展示了仅基于 H3K27ac CUT&amp;Tag、仅基于基因表达以及整合后的多组学数据集（CUT&amp;Tag + 基因表达）所注释的细胞群体。 （B）空间 Trekker–CUT&amp;Tag 多组学数据的空间表征。利用 Trekker 条形码将整合多组学数据集中的细胞核分配至空间坐标，揭示了小鼠脑组织切片中细胞类型解剖学上的有序分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/71046/71046fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
CUT&amp;Tag 和基因表达文库的测序与比对采用 Cell Ranger ARC v2.0.2 软件，遵循 10x Genomics 的操作指南；空间条形码文库则使用 Trekker v1.3.0 软件，按照 Takara Trekker 的推荐方案进行处理。CUT&amp;Tag 文库采用了建议的单细胞 ATAC-seq 比对参数。分别生成了仅包含 CUT&amp;Tag、仅包含基因表达以及联合多组学（CUT&amp;Tag + 基因表达）的单细胞核数据集。根据 Signac22 的标准，过滤掉 CUT&amp;Tag 总 UMI 数 ≥ 1,000,000 或 ≤ 100，或基因表达总 UMI 数 ≥ 100,000 或 ≤ 1,000 的细胞。双细胞（doublet）预测结合使用 scDblFinder23（用于基因表达数据）和 AMULET24（用于 CUT&amp;Tag 数据）进行。满足以下任一条件的细胞被剔除：1）scDblFinder.score &gt; 0.6；2）scDblFinder.score 在 0.3 至 0.6 之间，且 amulet.score &lt; 0.01。细胞类型注释基于 Allen 脑细胞图谱的参考数据26，使用 Seurat 的 FindTransferAnchors 方法完成25。本研究中，基因表达文库的每个细胞中位 UMI 数为 15,378，每个细胞中位基因数为 4,378。对于 CUT&amp;Tag 文库，共检测到 11,860 个细胞，每个细胞中位高质量片段数为 6,631，TSS 富集得分为 7.66。对于 Trekker 空间条形码文库，92.43% 的细胞核被分配了空间位置，其中 51.54% 的细胞核被唯一确定至单一空间位置。原始测序数据及二次分析处理后的数据可通过 GEO 数据库获取，登录号为 GSE327406。最终经过质控后注释的 Seurat 对象可在 Zenodo 上获取，登录号为 19475899。带有细胞类型注释的代表性 UMAP 降维图见图 4A。通过将单细胞条形码与空间条形码关联，将各个细胞核回溯至其在组织中的原始空间位置，从而生成空间分布图（图 4B）。该图谱与相邻组织切片中观察到的解剖特征高度一致，并与 Allen 脑图谱27 中的小鼠脑冠状切面标准参考图谱相吻合。在单细胞分辨率下对空间基因表达和 H3K27ac 谱型进行联合分析，实现了主要脑细胞类型的鉴定，并揭示了组织切片中细胞分布的解剖学有序模式。

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。

空间多组学技术与单细胞分析相结合，为阐明分子与细胞架构提供了前所未有的机遇……

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

冷冻组织切片中转录组和表观基因组靶点的空间分辨、集成多组分析

收集连续的冷冻切片，以实现组织学应用，并利用单个小鼠骨骼肌的相邻区域富集RNA，用于基因表达检测。从20 - 30 mg...

单只小鼠骨骼肌连续区域的冷冻切片用于基因表达与组织学分析

我们介绍一种对冷冻组织进行多光谱成像的快速染色方法。...

一种用于冷冻组织切片多光谱荧光成像的快速方法

肿瘤内异质性是包括胶质瘤在内的各种肿瘤的固有特征。我们开发了一种简单高效的实验方案，通过结合使用多种缓冲液和梯度离心方法，从新鲜冷冻的胶质瘤组织中分离单个细胞核，用于单细胞核RNA测序和ATAC测序研究。...

从新鲜冷冻脑肿瘤组织中分离细胞核用于单核RNA测序和ATAC测序

本文介绍了一种针对空间组学技术中感兴趣区域（ROIs）进行精细优化的实验方案，以更准确地表征肿瘤微环境并鉴定特定的细胞群体。对于蛋白质组学检测，可采用自动化的定制化流程来指导ROIs的选择；而在转录组学检测中，则可利用小至50...

组织中蛋白质与RNA表达的空间分析：优化虚拟显微切割的一种方法

本文介绍一种从速冻保存的存档肝组织中分离细胞核的方案，用于单细胞核RNA测序（RNA-seq）、ATAC-seq以及联合多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq）。...

从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

本研究介绍了一种简单、快速且部分自动化的方案，用于从冷冻的哺乳动物组织中分离高质量的细胞核，以用于后续的单细胞核RNA测序。...

一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

本方案提供了一种可靠且经过优化的方法，用于从实体瘤样本中分离细胞核，以进行基于10x...

优化从新鲜及冷冻实体瘤标本中分离细胞核以进行多组学测序

视网膜在其层状结构中表现出复杂的空间组织。现代空间转录组学和测序技术需要厚度小于&lt; 20 µm的组织切片，这限制了其在视网膜研究中的应用。本新鲜冷冻冷冻切片方法可在保持视网膜平面空间关系的同时，制备小鼠视网膜的薄层en...

En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

本文介绍了一种利用Stereo-seq对福尔马林固定石蜡包埋组织切片中的宿主、病毒、真菌及微生物组RNA进行全方位空间转录组分析的实验方案，该技术可在保留组织结构的同时实现多种转录组的高分辨率定位。...

跨物种转录组的全面空间剖析 通过 Stereo-seq

单细胞测序是一种日益流行且易于获取的工具，可用于高分辨率地研究基因组变化。我们提供了一种利用单细胞测序在单个细胞中鉴定拷贝数变异的实验方案。...

使用单细胞测序检测拷贝数变异

学习空间多组学工作流程，通过空间条形码与单细胞分析技术，在冷冻脑组织切片中同时分析H3K27ac组蛋白修饰和基因表达。该方法将表观基因组与转录组数据整合到相同细胞核，实现精确的细胞类型注释，揭示空间调控程序与细胞间相互作用，为神经科学研究提供高分辨率的分子图谱。

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

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