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本工作得到了先进材料-国家科技重大专项（项目编号：2024ZD0603600）的支持。广东省科学技术厅也提供了额外资助。&amp;#38;T 计划（资助编号：2024B1111130002）。

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Xiaojie Guo 和 Liyan Wang 是江苏泰沐微流控科技有限公司的员工，该公司生产本研究中使用的自动化液滴微流控平台和微流控芯片。该公司声明，其在本研究中无任何竞争利益，且未参与研究设计、数据收集、分析、解释或手稿撰写。其他作者声明无任何竞争利益。

本方案介绍了一种基于自动化液滴微流控平台的工业微生物筛选标准化工作流程。该集成化工作流程涵盖突变体文库构建、液滴生成与单细胞包封、微反应器培养、生物传感器注入、荧光激活液滴分选以及目标菌株的最终验证。以高产L-乳酸的B. coagulans高通量筛选作为验证案例，该工作流程在B. coagulans菌株改良中展现出相较于传统微孔板和琼脂平板方法的多项优势。在筛选通量和效率方面，该平台利用微流控芯片并行生成和处理每秒数千至数万个液滴，单轮筛选通量较传统基于微孔板的方法提高了约104倍12。针对B. coagulans，该工作流程可在4&#160;h内完成106个液滴的筛选，从而将菌株开发周期从数周缩短至数天，显著加快育种进程。FADS系统的筛选效率约为基于平板筛选系统的3 × 103倍，同时显著降低了设备、人力和耗材成本13。然而，由于不同微生物自身的特性差异，需对该标准工作流程进行针对性优化。例如，酵母培养36 h后，渗透压...

工业生物技术利用微生物和酶作为生物催化剂，大规模生产高价值产品。与传统的化学制造方法相比，这种方法被认为更环保且高效。然而，微生物的天然代谢网络在进化过程中优先保障其自身的生存与繁殖，而非高效合成人类所需的产品。因此，通常需要通过高通量微生物育种来满足工业生产中严格条件的要求1,2,3。该过程包括通过物理或化学诱变快速构建大规模的微生物突变体文库，随后对具有不同基因型的突变体进行培养和表型检测，并从中筛选出极少数优良菌株。然而，传统的基于平板和微孔板的筛选技术受限于操作繁琐、通量低以及成本高昂。这一瓶颈，加之耗材和试剂的大量消耗，导致微生物育种的整体效率较低4,5。
近年来，液滴微流控技术已成为解决这一挑战的变革性方案。与荧光激活细胞分选（FACS）不同，FACS因分子会迅速从细胞周围扩散而不适用于分泌产物的筛选；而荧光激活液滴分选（FADS）则将单个细胞封装在皮升级、区室化的微反应器中6,7,8。这种物理隔离可防止菌株间的竞争，实现分泌代谢物的局部富集，并可通过荧光生物传感器对其进行定量检测。因此，FADS已被证明是高通量筛选多种胞外产物（包括氨基酸、有机酸和酶）的理想平台。一个研究团队开发了基因编码的荧光生物传感器GECFINDER，并将其与FADS结合，成功筛选出高产苯丙氨酸的菌株，筛选效率提高了1000倍以上9。另一研究小组建立了基于基因编码生物传感器的荧光激活液滴分选平台，用于大肠杆菌（E. coli）中3-脱氢奎尼酸高产菌株的高通量筛选，优化后的FADS系统显著提高了筛选效率，并实现了产量显著提升的突变菌株的分离10。一些研究人员将FADS技术应用于Bst DNA聚合酶的改造，获得的突变体具有显著增强的热稳定性和链置换活性，并进一步应用于LAMP检测，使反应时间从40分钟缩短至10分钟11。
然而，将这些技术进步转化为常规的工业菌株开发工作流程仍然具有挑战性。许多商用液滴微流控系统尽管硬件先进，但仍缺乏一套完整、直观且可重复的标准操作程序，以满足微生物表型筛选的需求。为弥补这一空白，本研究采用了一种集成了模块化流体控制、用户友好型软件和标准化芯片设计的自动化液滴微流控平台，为建立完全整合的筛选工作流程奠定了理想的技术基础。本研究以高产L-乳酸的B. coagulans菌株的高通量筛选作为验证案例。基于该液滴微流控平台，建立了包含四个关键顺序步骤的工作流程：（1）通过常压室温等离子体（ARTP）诱变构建多样性突变体文库；（2）在优化的B. coagulans生长及L-乳酸生产条件下，实现单细胞的高效封装及液滴内的可控微培养；（3）精确地向液滴中皮升级注射L-乳酸特异性荧光生物传感器，随后高速分选包裹高性能生产菌株的液滴；（4）通过摇瓶发酵对分选获得的候选菌株进行严格验证，确认其产量提升及遗传稳定性。本方案适用于从事工业微生物育种、需要对外分泌产物进行高通量筛选的研究人员和工程师。尤其适用于能够培养并分泌小分子代谢物或酶类的细菌。筛选平台必须配备与液滴微环境兼容的传感器，以实现对目标代谢物的特异性检测。对于具有特殊培养需求的菌株（如严格厌氧菌），可调整培养参数，优化并建立专用的培养策略。通过建立这一闭环式、标准化的筛选工作流程，本研究旨在为加速工业菌株育种提供一种强大且可转移的解决方案。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>214030</td><td>用于固体平板的制备</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10009218</td><td>用于擦拭和消毒实验台面及仪器设备</td></tr><tr><td>常压室温等离子体（ARTP）</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>CP-002</td><td>ARTP&amp;nbsp;用于构建突变文库以进行菌株诱变</td></tr><tr><td>B. coagulans</td><td>北京微生物菌种保藏中心，BMCC</td><td>1511C0004000002355</td><td>以B. coagulans ATCC 7050作为起始菌株进行诱变，并作为高通量液滴筛选的目标菌株</td></tr><tr><td>黑色微孔板（96孔）</td><td>Corning</td><td>3925</td><td>96孔黑色微孔板用于乳酸传感器检测及乳酸浓度测定</td></tr><tr><td>碳酸钙</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>20011062</td><td>用于分离L-乳酸高产菌株</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>国药集团</td><td>10005819</td><td>氯化钙用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>L-乳酸钙</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>69027528</td><td>作为检测过程中标准曲线制备的样品</td></tr><tr><td>离心管（15 mL）</td><td>北京新恒岩科技有限公司</td><td>HB53397</td><td>用于菌液稀释</td></tr><tr><td>收集管</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>DREMcell-CL</td><td>用于收集液滴并进行后续培养</td></tr><tr><td>计算机</td><td>联想</td><td>E450</td><td>用于软件安装及DREM Cell仪器控制</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Solarbio</td><td>c0065</td><td>用于细胞染色</td></tr><tr><td>深孔板（24孔）</td><td>BKMAMLAB</td><td>110424008</td><td>用于利用深孔板对B. coagulans突变株进行初步产量验证</td></tr><tr><td>破乳剂（1H,1H,2H,2H-全氟辛醇）</td><td>MACKLIN</td><td>H817022</td><td>&amp;nbsp;液滴破乳剂用于破坏油包水微液滴，释放内部细胞、菌株或上清液，以便后续检测与分析</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Solarbio</td><td>G8150-1000</td><td>D-葡萄糖用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>柠檬酸氢二铵</td><td>Solarbio</td><td>D9950</td><td>&amp;nbsp;柠檬酸氢二铵用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td>无水磷酸氢二钾用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>DREM软件版本</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>DREMcell v02.01.18</td><td>用于控制DREM Cell仪器。DREM软件是江苏泰茂生物科技股份有限公司专有的商业程序，仅供DREM Cell仪器使用，无公开的官方访问或下载链接，仅随仪器授权分发</td></tr><tr><td>液滴捕获微流控细胞分选仪（DREM Cell）</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>CP-027</td><td>用于高通量单细胞包封与分选，快速从突变文库中筛选高产菌株</td></tr><tr><td>液滴生成芯片</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>HC-03-009</td><td>液滴生成芯片用于产生单分散的皮升级（pL）液滴，实现单细胞包封</td></tr><tr><td>液滴注射芯片</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>HC-03-003</td><td>液滴微注射芯片用于向预先形成的液滴中实现精确微量试剂注入，以进行后续生化反应</td></tr><tr><td>液滴分选芯片</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>HC-03-002</td><td>液滴分选芯片用于根据荧光信号对含有高产细胞的目标液滴进行分选</td></tr><tr><td>锥形摇瓶（250 mL）</td><td>四川蜀牛玻璃仪器有限公司</td><td>B-001006</td><td>用于在深孔板初筛后对B. coagulans突变株进行扩大培养验证，以确认高产菌株的稳定性与可重复性</td></tr><tr><td>滤膜（0.22 &amp;mu;m）</td><td>Merck</td><td>SLGPR33RB</td><td>用于发酵液的过滤</td></tr><tr><td>荧光倒置显微镜</td><td>Olympus</td><td>&amp;nbsp;IX73</td><td>使用Olympus IX73荧光倒置显微镜观察液滴内的细菌形态&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>氟化油</td><td>Bio-Rad</td><td>1864006</td><td>氟化油在液滴微流控中作为连续相，生成稳定、单分散且无干扰的油包水微液滴，支持单细胞培养与筛选</td></tr><tr><td>高效液相色谱柱</td><td>Bio-Rad</td><td>Bio-Rad Aminex HPX-87</td><td>根据乳酸与其他组分在色谱柱中的保留特性差异进行分离，实现乳酸的准确定量检测</td></tr><tr><td>高效液相色谱</td><td>岛津</td><td>&amp;nbsp;228-34001-02</td><td>HPLC用于发酵样品中L-乳酸的定量检测与分析</td></tr><tr><td>注射管</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>DREMcell-1N</td><td>用于注入油相、样品菌悬液和试剂溶液</td></tr><tr><td>七水合硫酸铁(III)</td><td>Iron(III) sulfate heptahydrate</td><td>Iron(III) sulfate heptahydrate</td><td>Iron(III) sulfate heptahydrate</td></tr><tr><td>超净工作台</td><td>上海申浦仪器设备有限公司</td><td>SP20230501</td><td>用于B. coagulans培养与发酵过程中的无菌操作</td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>国药集团</td><td>10013018</td><td>酵母提取物用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>一水合硫酸锰</td><td>MACKLIN</td><td>M813856</td><td>&amp;nbsp;一水合硫酸锰用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>TECAN</td><td>TCAT92000001</td><td>用于在微孔板中对乳酸传感器-乳酸混合物进行485/515 nm荧光检测</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>江苏泰茂生物科技股份有限公司</td><td>Miss cell-BOS-B</td><td>用于液体表面密封，隔绝空气，防止样品挥发、氧化及微生物污染</td></tr><tr><td>万用表</td><td>SNAKOL</td><td>SK-9205Pro</td><td>用于检测液滴注射芯片和液滴分选芯片上电极的导通性</td></tr><tr><td>pBAD-eLACCO1.1</td><td>Addgene</td><td>167947</td><td>eLACCO1.1乳酸传感器可在微液滴内实现基于荧光的L-乳酸实时定量，从而实现对高产B. coagulans突变株的高通量筛选</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>诺唯赞</td><td>G101</td><td>注入等渗PBS缓冲液以维持液滴内稳定的pH和渗透压环境，从而确保乳酸传感器的最佳性能并提高筛选准确性。PBS组分：10 mM磷酸盐缓冲液，137 mM NaCl，2.7 mM KCl，pH 7.4 &amp;plusmn; 0.1（25 &amp;deg;C）</td></tr><tr><td>摇床</td><td>上海智城仪器有限公司</td><td>10240211</td><td>用于B. coagulans的培养与发酵过程</td></tr><tr><td>无水乙酸钠</td><td>Solarbio</td><td>S5330</td><td>&amp;nbsp;无水乙酸钠用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>国药集团</td><td>10019318</td><td>氯化钠用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10021618</td><td>用于以5 mM浓度进行液滴流动性测试</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td>胰蛋白胨用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>SANYO Ultra-low&amp;nbsp;</td><td>MDF-U4086S&amp;nbsp;</td><td>用于菌株保藏（-80 &amp;deg;C）</td></tr><tr><td>超纯水净化系统</td><td>Merck</td><td>17100500</td><td>用于实验室超纯水的制备</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td>酵母提取物用于微生物培养基的配制，为微生物生长提供必需营养</td></tr></tbody></table>

高通量筛选l-乳酸高产菌株 bacillus coagulans 利用自动化液滴微流控平台筛选突变体

High-Throughput Screening of L-Lactic Acid-Hyperproducing Bacillus coagulans Mutants Using an Automated Droplet Microfluidic Platform

工业生物制造依赖微生物在工程化条件下高效合成目标产物。然而，野生型菌株由于其固有的代谢网络，通常缺乏实现这一目标的能力。因此，从大规模突变体文库中快速、准确地筛选高性能菌株，是工业微生物育种中的关键步骤。近年来，液滴微流控技术因其高通量、低消耗以及单细胞分隔能力而受到广泛关注，推动了多种单细胞分选系统的开发。本研究提出了一种基于自动化液滴微流控平台的工业微生物菌株高通量筛选方案。该集成化工作流程包含四个关键阶段：通过常压室温等离子体（ARTP）诱变构建突变体文库；在皮升级液滴中实现高效的单细胞包裹与可控微培养；精确皮升级注射荧光生物传感器，随后通过荧光激活液滴分选（FADS）分离含有高产变异体的液滴；以及通过微孔板和摇瓶发酵验证所分选的候选菌株。该完整且集成的筛选流程旨在作为标准化模板，其有效性通过分离高产L-乳酸的B. coagulans突变体这一具体实例得以验证。这一自动化、高通量的筛选平台为加速高性能菌株的工业育种提供了强有力的技术解决方案。

基于自动化液滴微流控平台，建立了一种高通量筛选模型。通过ARTP诱变技术构建了B. coagulans的突变体文库，最佳辐照时间为20 s，致死率约为90%（图4A）。随后将突变细胞以1500 Hz的生成速率包裹进体积为14 pL、直径约30 µm的液滴中（图4B）。在45 °C下孵育10 h后，以200 Hz的速率向每个液滴中皮升级注入传感器（图4C）。使用488 nm激光以100 Hz的频率进行荧光激活液滴分选（图4D）。收集分选出的阳性液滴，破乳后挑取单菌落进行验证。挑取的菌落首先在含有发酵培养基的24孔深孔板中于50 °C、200 rpm条件下培养24 h。利用酶标仪在激发波长485 nm、发射波长515 nm下测定各孔的荧光强度。选择荧光强度高于亲本菌株均值加三个标准差的克隆。将这些候选克隆进一步转接至250 mL摇瓶中，接种量为10%，在相同条件下继续发酵24 h。最后通过高效液相色谱法测定L-乳酸浓度（图4E）。...

本方案介绍了一种用于工业微生物的标准高通量筛选流程。该流程包括通过ARTP诱变构建突变体文库，利用自动化微流控技术进行正向液滴筛选，随后对筛选结果进行验证。该工作流程的可靠性已通过筛选高产B. coagulans菌株得到验证。

高通量筛选L-乳酸高产菌株 Bacillus coagulans 利用自动化液滴微流控平台筛选突变体

工业生物制造依赖微生物在工程化条件下高效合成目标产物。然而，野生型菌株……

high-throughput-screening-l-lactic-acid-hyperproducing-bacillus

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

利用自动液滴微流控平台高通量筛选L-乳酸高产 芽孢杆菌凝血蛋白 突变体

我们已开发出全面且无偏倚的全基因组筛选方法，以研究基因-药物和基因-环境之间的相互作用。本文介绍了对这些突变体文库进行筛选的方法。...

条形码酵母文库的竞争性基因组筛选

我们介绍一种低成本、高通量的方法，用于在大肠杆菌（E.

高通量筛选真菌内切葡聚糖酶活性 大肠杆菌

我们提出一种自动化、模块化的高通量方法，用于小规模微生物胞外多糖的鉴定与表征。该方法结合快速初筛以分析分泌多糖的总量，以及详细的碳水化合物指纹图谱分析，从而实现对新分离细菌菌株或完整菌株库的快速筛选。...

自动化模块化高通量胞外多糖筛选平台结合高灵敏度碳水化合物指纹图谱分析

本研究提出了一种高通量筛选方法，采用一种通用的遗传性酶筛选系统，理论上可应用于200多种酶。在此，通过更换所用底物，该单一筛选系统即可识别三种不同的酶（脂肪酶、纤维素酶和碱性磷酸酶）p对硝基苯乙酸酯，p-硝基苯基-β-D-纤维二糖苷，以及苯基磷酸盐。...

基于高通量基因酶筛选系统的多酶筛选

本文介绍了一种已成功建立的高通量检测方法，可用于筛选大量小分子化合物文库，以评估其调控细胞内环二鸟苷酸（cyclic di-GMP）水平的潜在能力...

建立高通量筛选调控c-di-GMP信号通路小分子的实验体系 铜绿假单胞菌

单细胞微流控分析 Bacillus subtilis

本文介绍一种可灵活应用的全生物体高内涵筛选工具，可用于研究宿主与病原体之间的相互作用，并适用于药物发现。...

一种高通量、高内涵、基于液体的 C. elegans 病理系统

Salmonella spp./Shigella spp. 是导致腹泻的常见病原体。本文介绍一种高通量平台，用于通过实时 PCR 结合导向培养法对 Salmonella spp./Shigella spp.

一种用于高通量筛选的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 种（spp.）

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。...

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

本方案描述了如何使用单细胞微升级液滴培养组学系统（MISS cell）进行微生物单克隆分离、培养和挑取。MISS cell...

利用单细胞微升液滴培养组学系统实现微生物单克隆的自动化与高通量培养及挑取

Anhui Polytechnic University.  该方案为工业微生物提供了标准的高通量筛选流程。该方法包括通过ARTP诱变构建突变体文库，利用自动微流控进行阳性滴滴筛查，随后验证结果。通过筛选高产 的B. coagulans 菌株验证了工作流程的可靠性。

高通量筛选L-乳酸高产菌株 Bacillus coagulans 利用自动化液滴微流控平台筛选突变体

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