在人类胚胎干细胞的线粒体复杂的活动初探
June 17th, 2008
在这段视频中，我们将向您可以分析人类胚胎干细胞的线粒体呼吸链复合物如何使用凝胶活性测定。
线粒体 在细胞生理学中起着许多作用，从新陈代谢和能量产生到编程细胞死亡，再到类固醇激素合成。尽管线粒体在基本细胞功能和疾病中都很重要，但人们对线粒体在人类胚胎干细胞及其分化后代中的功能知之甚少。在本视频中，我们将向您展示如何使用 Ingel 活性检测分析人 amry 干细胞的线粒体呼吸链复合物。
大家好，我是来自加州大学洛杉矶分校病理学和检验医学系 Michael Tetel 实验室的 Ivan OV。今天，我们将向您展示一种评估人胚胎干细胞中线粒体呼吸复合物功能的程序。这些凝胶活性评估该程序涉及从人胚胎干细胞中分离粗线粒体腭，通过更高分辨率的透明天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分离渗出磷酸化系统的线粒体复合物，以及随后的凝胶活性 sa。
那么让我们开始吧。该程序的第一步是从人胚胎干细胞中分离线粒体。对于该测定，我们将使用在无饲养层条件下在基质胶覆盖的平板上生长的人胚胎干细胞。
为了从我们的人类 amry 干细胞中收集线粒体，我们首先用温热的 XPDS pH 7.4 洗涤它们，然后用胰蛋白酶对细胞进行 5 分钟。您可以在六孔板中每孔使用 1 密耳的 x 胰蛋白酶。5 分钟后，您可以通过在一个 XPBS 中加入等体积的新鲜胰蛋白酶抑制剂 1 毫克/密耳来终止反应，并收获细胞。
然后将收集的细胞在室温下以 200 倍 G 离心 5 分钟。离心后，弃去上清液并复苏，将沉淀的细胞悬浮在 0.8 至 1.7 mL 冰冷的线粒体分离缓冲液中，并加入新鲜制备的一种蛋白酶抑制剂混合物。您使用的缓冲液量取决于您获得的细胞沉淀的大小 沉淀重悬后，在冰上孵育约 10 分钟。
在用匀浆器孵育细胞后，这可能需要大约 40 到 50 次冲程。我们可以通过用 trian blue 染色等分试样的 DOD 细胞并通过光学显微镜观察来检查匀浆的完整列表。它应如下所示。
这是 50 杆后的第一杆。这是 80 杆后第二次击球。细胞匀浆后，将它们在 4 摄氏度下以 20， 000 倍 G 离心 10 分钟，这将得到一个粗的线粒体沉淀，其中也将包含细胞核和较大的细胞碎片。
在收集沉淀之前，我们必须称量收集管以估计随后的沉淀重量，倒出并丢弃上清液，然后称量沉淀的粗线粒体沉淀。通过减去此时管子的重量，可以继续溶解沉淀，这将在下一步中显示。为了溶解粗线粒体沉淀，我们首先将沉淀保持在冰上并用 35 微升冰冷的增溶缓冲液涡旋。
对于每 20 毫克沉淀，我们随附的书面方案中提到了有关缓冲化合物的详细信息。涡旋并加入增溶缓冲液后，在加入 digit toin 之前，我们将重悬的沉淀转移到适合高速离心的试管中，然后我们加入 20 微升每体积重量为 10% 的 digit toin，以获得 20 毫克的颗粒重量，并在充分混合后轻弹试管混合，将线粒体沉淀在冰上孵育 5 至 10 分钟。Doil beta D 多面或 DDM 或 Triton X 100 可以替代 digit toin 以溶解蛋白质。
去污剂的选择及其数量可能会影响在冰上孵育后线粒体复合物的上复合物或多聚体形式的形成。一旦沉淀溶解，我们将它以 10 万倍 G 的速度在 4 摄氏度下离心 15 分钟，然后我们将收集澄清的上清液。我们现在已准备好准备上清液，以便在我们的梯度凝胶上运行，以进行线粒体的天然梯度凝胶电泳。
我们建议使用 5% 至 13% 的丙烯酰胺梯度凝胶和 3.5% 浓缩胶。为了制备凝胶，我们将按照书面方案中的说明使用丙烯酰胺双丙烯酰胺混合物。丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液是预先制备的，并在 4 摄氏度下避光保存。
丙烯酰胺和双丙烯酰胺是粉末和液体形式的有毒化学物质，因此在使用它们时应特别注意。我们将丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液与由 1.5 摩尔 6 氨基六硝酸和 75 毫摩尔 ole 在 pH 7.0 下的 3 x 凝胶缓冲液等分试样混合。我们添加到缓冲液中的丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液的量将取决于我们制备梯度凝胶的凝胶百分比。
我们将制作一个 4% 混合物和一个 13% 混合物，堆积凝胶将是 3.5% 混合物。不要忘记将甘油添加到 13% 混合物中。当所有三种混合物都准备好后，我们在每个硫酸盐和 temid 中加入适量的铵，然后将混合物倒入梯度成型铸造室中。
腔室的左侧部分包含 5% 混合物。腔室的右侧部分包含一个小型磁力搅拌棒中的 13% 混合物。我们通过打开腔室的右侧部分开始倒入凝胶。
然后我们立即打开腔室的左侧部分，让 5% 溶液与 13% 溶液混合以形成梯度。我们在凝胶顶部加入少量异丙醇，以便在聚合后为凝胶形成一个尖锐的直线边界。大约一小时后，当梯度凝胶聚合完成时，我们去除异丙醇，将 3.5 浓缩凝胶倒入装置中并插入凝胶梳。
我们将在大约 4 到 7 摄氏度的冷藏室中组装和运行凝胶。为了电泳这块凝胶，我们将使用两种不同的缓冲液。在阳极室中，我们将使用含有 25 毫摩尔盐酸 pH 7.0 的缓冲液。
阴极缓冲液将包含 50 毫米 tric、7.5 毫摩尔的盐酸、0.02% 的每体积重量、doil beta D 多面或 DDM 和 0.05% 重量体积比、脱氧涂层 pH 7.0。为了制备要在我们刚刚倒入的凝胶中运行的上清液，添加上样缓冲液以产生 5% 重量比的甘油和 0.01% 重量比的甘油。Ponto S 中，我们通常将含有甘油和雨披的 10 x 储备溶液直接添加到上清液中。
现在我们准备好将凝胶样品上样到凝胶上。我们将用每个泳道含有 20 至 40 毫克粗线粒体蛋白的体积加载凝胶孔。上样后，凝胶立即在 100 V 电压下电泳。
一旦样品进入浓缩胶，电压可以提高到 500 伏，电流限制为 15 毫安。虽然我们通常在 70 至 100 伏特下运行凝胶过夜，但当红色 zos 染料的锐线接近凝胶前沿时，我们会停止电泳。现在凝胶已经电泳，我们可以直接在凝胶中分析不同蛋白质复合物的活性。
每次测定的孵育时间取决于蛋白质溶解的效率和每孔的上样材料量。复合物 1、4 和 5 通常比复合物 2 和 3 产生更强的信号。这就是为什么复合物 2 和 3 的染色时间应该更长。
为了测试复杂活动，我们需要为每个复杂体使用特定的缓冲区。您可以在书面方案中找到各个缓冲液的成分。现在我们将剪掉凝胶的各个泳道 以单独进行 Ingel 活性测定。
对于所有复合物，对于除复合物 5 之外的所有复合物，将凝胶切片在各自的缓冲液中在室温下孵育数小时。孵育后，将凝胶在 50% 甲醇和 10% 乙酸中固定 15 至 45 分钟。固定的凝胶保存在 10% 乙酸中。
您在这里可以看到复合物 1 的染色是如何出现的。凝胶切片中有一条深紫色条带，对应于复合物条带。透明凝胶可让您对线粒体复合物活动进行密度测定并进行比较分析。
密集细胞术后，我们通常会干燥凝胶切片以进行长期储存和/或扫描，以获得高质量的图像复合物，两种染色剂的紫色与一种复合物 3 和复合物 4 相同。两者都有橙色或淡黄色的染色带。以下是复杂的 2、3 和 4 染色活动的示例。
我们刚刚向您展示了如何分析线粒体渗出复合物的活性，这些复合物是从人胚胎干细胞中提取的，并通过更高分辨率（包括天然凝胶电）进行分离。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本视频展示了使用凝胶活性测定分析人类胚胎干细胞线粒体呼吸链复合物。强调了线粒体在细胞功能和疾病中的重要性，并强调了解它们在干细胞中的作用的必要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生理学
- 线粒体功能
- 干细胞研究
背景
- 线粒体对于代谢和能量生产至关重要。
- 它们在程序性细胞死亡和类固醇激素合成中发挥作用。
- 对人类胚胎干细胞中线粒体功能的理解有限。
- 本研究旨在填补这一知识空白。
研究目的
- 评估人类胚胎干细胞中线粒体呼吸复合物的功能。
- 利用凝胶活性测定进行分析。
- 增进对干细胞生物学中线粒体作用的理解。
使用的方法
- 从人类胚胎干细胞中分离粗线粒体沉淀物。
- 使用透明天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分离线粒体复合物。
- 应用凝胶活性测定评估复合物功能。
- 加州大学洛杉矶分校研究人员示范程序。
主要结果
- 成功分离线粒体复合物。
- 呼吸链分析的凝胶活性测定示范。
- 对干细胞中线粒体功能的洞察。
- 对理解干细胞分化的潜在影响。
结论
- 该研究提供了分析干细胞中线粒体功能的方法。
- 它强调了线粒体在细胞过程中的重要性。
- 进一步的研究可能会导致干细胞治疗的进展。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct measurement of mitochondrial respiratory complex activity in human embryonic stem cells (hESCs) addresses a critical gap in understanding cellular energy metabolism during early development. High-resolution in gel activity assays enable quantitative assessment of mitochondrial function, supporting predictive confidence in stem cell viability and differentiation potential. This capability informs risk-adjusted decisions at the intersection of discovery biology and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of mitochondrial function as a determinant of stem cell fate and viability.
- Supports biological de-risking by clarifying the role of respiratory complexes in hESCs.
- Provides functional target validation for mitochondrial pathways relevant to disease modeling.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, quantitative assays for mitochondrial complex activity in stem cell systems.
- Facilitates assay standardization and reproducibility for downstream compound screening.
- Enables reliable comparison of mitochondrial function across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial activity measurements with disease-relevant stem cell models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of metabolic phenotypes.
- Provides mechanistic insight for predictive de-risking in cell-based therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling functional assessment of mitochondrial complexes in hESCs, informing both early target validation and translational model development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mitochondrial contributions to stem cell function and differentiation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts of respiratory complex activity for assay development.
- Analytics: Provides densitometric measurements for comparative analysis of mitochondrial function.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by characterizing metabolic phenotypes in stem cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for mitochondrial functional analysis across diverse stem cell and progenitor systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell-based models by quantifying mitochondrial activity.
- Operational Value: Standardizes mitochondrial assays for reproducibility and scalability in R&D workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early-stage programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell and metabolic pathway targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mitochondrial isolation and native gel electrophoresis.
- Demands access to high-speed centrifugation and gel imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of assay buffers and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different stem cell lines or progenitor systems.
- Assay sensitivity and signal strength can vary by complex and sample quality.
