检测人类胚胎干细胞中线粒体复合物的活性

线粒体在细胞生理中具有多种功能，从代谢和能量产生，到程序性细胞死亡以及类固醇激素的合成。尽管线粒体在基本细胞功能和疾病中均具有重要意义，但目前对线粒体在人类胚胎干细胞及其分化后代中的功能仍知之甚少。在本视频中，我们将向您展示如何利用Ingel活性检测方法分析人类胚胎干细胞中线粒体呼吸链复合物。

您好，我是来自加利福尼亚大学洛杉矶分校病理学与实验室医学系 Michael Tetel 实验室的 Ivan OV。今天我们将向您展示一种用于评估人类胚胎干细胞中线粒体呼吸复合体功能的实验方法。该方法是一种凝胶内活性检测，包括从人类胚胎干细胞中分离粗制线粒体组分，利用高分辨率的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳对氧化磷酸化系统的线粒体复合体进行分离，随后进行凝胶内活性染色分析。

那么我们开始吧。该实验的第一步是从人类胚胎干细胞中分离线粒体。在此检测中，我们将使用在基质胶包被的培养板上、无饲养层条件下培养的人类胚胎干细胞。

为了从人源干细胞中收集线粒体，我们首先用预热的1×PDS（pH 7.4）洗涤细胞，然后用胰蛋白酶消化细胞5分钟。在六孔板中，每个孔可使用1 mL的1×胰蛋白酶。5分钟后，加入等体积的新鲜胰蛋白酶抑制剂（1 mg/mL溶于1×PBS）以终止反应，并收集细胞。

将收集的细胞在室温下以200 × g离心5分钟。离心后，弃去上清液，并用0.8至1.7毫升预冷的线粒体分离缓冲液重悬沉淀细胞，缓冲液中需加入新配制的1×蛋白酶抑制剂混合物。所用缓冲液体积取决于所获得的细胞沉淀量。细胞沉淀重悬后，置于冰上孵育约10分钟。

孵育后，我们使用匀浆器对细胞进行破碎，大约需要40到50次 strokes。可通过台盼蓝染色DOD细胞的一部分样品，并在光学显微镜下观察，以检查匀浆是否完全。结果应类似于如下所示。

这是经过50次下冲后的第一枪。这是经过80次下冲后的第二枪。细胞匀浆后，在4°C条件下以20,000 × g离心10分钟。这将得到一个粗制的线粒体沉淀，其中还含有细胞核和较大的细胞碎片。

在收集沉淀之前，需先称量收集管的重量，以估算后续沉淀物的重量，倒出并弃去上清液，然后称量沉淀的粗线粒体沉淀物。通过减去此时收集管的重量，即可得到沉淀物的净重，随后可进行沉淀物的溶解，这将在下一步中展示。为了溶解粗线粒体沉淀物，首先将沉淀物置于冰上，加入35 µL预冷的溶解缓冲液，并进行涡旋振荡。

对于每 20 毫克的沉淀物，缓冲液成分的详细信息均在随附的书面实验方案中说明。在涡旋并加入溶解缓冲液后、添加十二烷基麦芽糖苷（digitonin）之前，我们将重悬的沉淀物转移至适合高速离心的离心管中，然后按每 20 毫克沉淀物加入 20 微升 10%（重量/体积）的十二烷基麦芽糖苷，并通过轻弹管壁混匀；充分混合后，将线粒体沉淀物置于冰上孵育 5 至 10 分钟。可使用十二烷基β-D-麦芽糖苷（Doil beta D multiside，DDM）或 Triton X-100 替代十二烷基麦芽糖苷以溶解蛋白质。

去垢剂的选择及其用量可能会影响线粒体复合物在冰上孵育后超复合物或多聚体形式的形成。待沉淀溶解后，我们将在4°C条件下以100,000 × g离心15分钟，并收集澄清的上清液。此时，我们即可准备将上清液用于线粒体天然梯度凝胶电泳的梯度胶加样。

我们建议使用5%至13%的丙烯酰胺梯度胶，并配以3.5%的浓缩胶。制备凝胶时，我们将采用书面实验方案中所述的丙烯酰胺-双丙烯酰胺混合物。丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液需预先配制，并于4°C避光保存。

丙烯酰胺和双丙烯酰胺在粉末状态和液体状态下均为有毒化学品，因此在操作时需特别注意。我们将丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液与一份三倍凝胶缓冲液混合，该缓冲液由1.5摩尔的六氨基己酸和75毫摩尔的ole组成，pH值为7.0。加入缓冲液中的丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶液的量取决于我们所制备的凝胶百分比，以形成梯度凝胶。

我们将配制一种4%的混合液和一种13%的混合液，浓缩胶则使用3.5%的混合液。切记在13%的混合液中加入甘油。当三种混合液均准备好后，向各混合液中加入适量的过硫酸铵和TEMED，然后将混合液倒入梯度形成用的灌胶室中。

室的左侧含有5%混合液。室的右侧含有13%混合液，并放入一小段磁力搅拌子。我们通过打开室的右侧开始倒入凝胶。

然后立即打开电泳槽的左侧部分，使5%的溶液与13%的溶液混合形成梯度。在凝胶顶部加入少量异丙醇，以使聚合后凝胶形成清晰且平直的边界。大约一小时后，当梯度胶聚合完成时，去除异丙醇，并将3.5%的浓缩胶倒入装置中，插入梳子。

我们将在约4至7摄氏度的低温室中组装并运行凝胶电泳。进行此凝胶电泳时，我们将使用两种不同的缓冲液。在阳极室中，我们将使用含有25毫摩尔盐酸羟胺（pH 7.0）的缓冲液。

阴极缓冲液将包含 50 毫摩尔三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、7.5 毫摩尔盐酸羟胺、0.02%（重量/体积）正辛基-β-D-麦芽糖苷（DDM）和 0.05%（重量/体积）脱氧胆酸钠，pH 值为 7.0。为了制备刚刚灌注的凝胶中待电泳的上清液，需加入上样缓冲液，使其终浓度为 5%（重量/体积）甘油和 0.01%（重量/体积）Ponso S。我们通常直接向上清液中加入含有甘油和Ponso S的10×储存液。

现在我们准备将凝胶样品上样到凝胶中。每个泳道上样的体积应含有 20 至 40 毫克粗线粒体蛋白。上样后立即以 100 伏电压进行电泳。

当样品进入浓缩胶后，可将电压升至500伏，同时将电流限制在15毫安。尽管我们通常以70至100伏电压过夜运行凝胶，但当红色偶氮染料的清晰条带接近凝胶前沿时，即停止电泳。凝胶电泳完成后，可直接在凝胶中分析不同蛋白质复合物的活性。

每种检测的孵育时间取决于蛋白质溶解的效率以及每孔上样量的多少。复合物一、四和五通常比复合物二和三产生更强的信号，因此复合物二和三的染色时间应更长。

为了检测复合物的活性，我们需要为每种复合物使用特定的缓冲液。您可以在书面方案中找到各个缓冲液的成分。接下来，我们将切下凝胶中的各个泳道，以分别进行凝胶内活性检测。

对于所有复合物，除复合物五外，将凝胶切片在各自缓冲液中室温孵育数小时。孵育后，用50%甲醇和10%乙酸固定凝胶15至45分钟。固定后的凝胶保存于10%乙酸中。

您在此处可以看到复合物 I 的染色情况。凝胶切片中有一条深紫色条带，对应于复合物 I。透明凝胶可让您对线粒体复合物活性进行密度测定，并实现比较分析。

经过浓密的细胞计数后，我们通常将凝胶切片干燥，以长期保存或进行扫描，从而获得高质量的图像。两种染料使复合物三和复合物四呈现相同的紫色。两者均产生橙色或黄褐色的染色条带。以下是复合物二、三和四染色活性的示例。

我们刚刚向您展示了如何分析从人类胚胎干细胞中提取并经高分辨率分离（包括天然凝胶电泳）的线粒体渗出物复合物的活性。本次演示到此结束。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。