从MEFS iPS细胞生成通过强制SOX - 2的表达，10月4，c - Myc基因和Klf4
2008年4月7日
该视频显示程序生成诱导多能干细胞诱导慢病毒表达OCT4，SOX2，c - Myc和KLF4。
50 多年前，有人假设皮肤成纤维细胞等终末分化细胞可能被迫呈现类似于胚胎干细胞的多能状态。这个概念的基础是观察到，除了一些微小的例外，所有细胞类型都具有相同的遗传密码，并且细胞类型之间的唯一区别是密码的读取方式。这种将分化细胞的细胞身份转变为多能状态的能力称为细胞重编程。
经过五年的研究，最近表明，四种转录因子的强制表达可以重新编程皮肤成纤维细胞，使其变得多能。这一发现的影响是巨大的。除了对基础生物学的重要性外，它还克服了对使用人类胚胎干细胞进行移植治疗的主要伦理反对意见。
为了进行重编程，需要包装编码转录因子 OC 的 4 个基因、4 个 sox 2 个 cmic 和 K 4 个基因，并将其放入慢病毒组织培养物中。然后将含有纯化病毒的培养基添加到含有高密度成纤维细胞的细胞培养皿中，在该培养皿中，会发生一些令人惊奇的事情。一小部分成纤维细胞感染了所有四种携带转录因子的病毒并开始去分化。
它们的形态和增殖发生剧烈变化，并开始分裂成形成的多能干细胞的大型精神集群。在胚胎干细胞条件下培养 2 至 3 周后，可在体外手动分离和扩增重编程成纤维细胞的集落。纯化后，这些细胞可用于生成嵌合小鼠，其中一定比例的细胞来源于那些去分化的成纤维细胞，可以促进小鼠的不同组织。
在原始成纤维细胞的遗传物质对种系做出贡献的钟声中，遗传密码被传递给下一代，然后是下一代，然后是下一代。尽管目前使用病毒递送系统是临床应用的障碍，但这可能会在短时间内得到克服。在本视频中，yin 实验室的成员将演示如何从小鼠胚胎成纤维细胞中提取诱导性强效干细胞。
大家好，我是来自马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所 Rudolph Jish 实验室的 Grant Welted。我是 Tobias Bro brink，也是来自 ish 实验室的。今天，我们将向您展示通过引入四种 CDNA、OCT、4 SOX、2 CIC、KF 4 以及使用来自 Tet OCMV 启动子表达这四种 CDNA 的慢病毒来产生诱导多能干细胞。
这允许在小鼠胚胎成纤维细胞感染后精确控制这四个转基因的表达。我们今天向您展示的实验方案涉及可能感染人类细胞的慢病毒的处理。在您尝试自己执行此作之前，请务必始终遵循安全程序并联系您的安全办公室，这一点至关重要。
因此，让我们生成一些 IPS 细胞，以生成将 mes 转化为 IPS 细胞的慢病毒。2 9 3 细胞必须用 3 个质粒 Paks 2 转染，它为病毒包装提供了所需的遗传元件。病毒骨架是一种 FUW TE OCMV 慢病毒，具有四种 CD 辅助工具之一：T 4、SOX 2、KLA 4 或 CMIC PMDG，表达水泡性口炎病毒或 VSV 的包膜糖蛋白。
这使得病毒将产生 atropic 病毒。因此，需要遵循正确的 BL 二加程序。在这个特定的视频中，我们实际上并没有处理传染性病毒，因此我们没有穿着典型的防护服，也不在我们的 BL two plus 设施中。
在转染 2 之前，从液氮中解冻 9 3 个细胞并生长至 90%Co 流畅性细胞，然后用 FU 基因转染细胞并给予 48 至 72 小时以表达病毒，此时使用 0.45 微米过滤器过滤沐浴细胞的培养基，浓缩病毒后使用超速离心浓缩。我们现在准备感染 MES 以产生 IPS 簇在病毒制备步骤中，小鼠胚胎成纤维细胞传代不到 3 次，在 10 厘米培养皿中生长至 90% 共流畅度，大约是每个培养皿 6 个细胞的 10 倍的两倍。在这个特定的实验方案中，我们使用表达 RTTA 的 MES，这对于来自内源性 OC 四个基因座的多西环素表达和 GFP 至关重要。
MES 为 GFP 阴性，但真正的 IPS 细胞变为 GFP 阳性。该标记物允许一种识别重编程 mes 的方法，从成纤维细胞中吸出培养基并用 10 mil 的嬉皮士、EDTA 洗涤，丢弃嬉皮士 EDTA 并加入 5 mil 的 1 倍胰蛋白酶，并在 37 度下孵育 10 分钟。胰蛋白酶有助于将细胞从培养皿底部提起。
现在加入 9 mil 培养基，将细胞重悬于单细胞悬液中，并转移到 15 mil 试管中。然后将这些细胞旋转并沉淀。对悬浮沉淀进行复苏后，对悬浮液中的细胞数进行计数，并将浓度调节至每密耳 4 个细胞的 8 乘以 10。
然后将 10 mils 细胞悬液转移到涂有明胶的 10 cm 培养皿中。将培养皿在 37 摄氏度、5% CO2 下孵育过夜，然后吸出成纤维细胞培养皿中的过夜孵育培养基，并将 10 密耳含病毒的培养基加入到冰毒中。将细胞在 37 摄氏度、5% CO2 下孵育 4 小时至过夜。
第二天，从 fiberblast 培养皿中吸出培养基，然后加入 10 密耳的新鲜 ESL 培养基。在这个阶段，可以冷冻、扩增细胞或为开始重编程做好准备。要启动重编程，请用含有多西环素的培养基替换常规 ESL 培养基，以启动四个基因的表达。
将这些细胞放入培养箱中，每天更换培养基，直到集落变得足够大，可以挑选。菌落应在重编程开始后大约一周首次变得可见。它们应该变得足够大，可以在第 20 天左右被捡起。
现在 20 天已经过去了，我们可以在挑选菌落之前先挑选 IPS 菌落。应该记得在采摘前一到两个小时查看所需数量的明胶包被 24 孔板和 γ 辐照 DR 四个神话。应在挑取前通过添加新鲜培养基来喂养板上的菌落，在挑取前立即向 V 形底 96 孔培养皿的孔中加入 50 微升 HEPA 缓冲液，用 PBS 洗涤含有要挑取的菌落的培养皿一次，并向培养皿中加入 10 ml PBS IPS 细胞簇可以在立体或倒置显微镜下挑选。
用小移液器吸头挑取菌落，并将它们转移到含有 PBS 的 96 孔培养皿中的孔中，以去除簇。用移液器吸头在簇周围画一个圆圈，以分解数学运算。现在可以使用多通道移液器提取重编程的细胞，向每个细胞中加入 20 μL tripsin。
将其上下管道上下管道 3 次，在 37 摄氏度下孵育 4 分钟。孵育 4 分钟后，将 100 μL ES 培养基添加到 tripps nice 菌落中。上下管道 10 次，一次转移 6 个克隆。
从 96 孔培养皿到 24 孔培养皿，在 12 位的每隔位置使用吸头，然后将移液管细胞在 24 孔板上在 37 美分、5%CO2 培养箱中培养，直到细胞达到 80% 至 90% Co 流畅度，与 ES 细胞培养基拟合熟食细胞可能在 3 到 7 天内准备好扩增几天后。现在 IPS 细胞已汇合，吸出培养基并用 1 mil 的嬉皮士完全洗涤细胞 取出嬉皮士，加入 100 微升 1 倍胰蛋白酶，在 37 摄氏度下孵育 10 分钟。与胰蛋白酶孵育后，加入 400 μL ESL 培养基，通过上下吹打悬浮细胞，产生单细胞悬液。
然后将来自 24 孔的 500 μL 单细胞悬液转移到六孔板的单孔中，并在 37 摄氏度的 5%CO2 培养箱中孵育，直到细胞在六孔板中达到 80% 至 90% 的 co fluness。此时，您可以继续扩增细胞以进行 Southern 分析、原始细胞、注射、畸胎瘤检测或体外分化检测。您应该记住冷冻这些细胞的库存阀，以免丢失这些宝贵的 IPS 细胞库存。
我们刚刚向您展示了如何使用诱导型抗病毒系统在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导多能性。因此，感谢您的观看，祝您的实验好运。
概述
本视频演示了使用棘皮病毒系统从小鼠胚胎成纤维细胞中生成诱导多能干细胞（iPSCs）的程序。该方法涉及引入四种转录因子：Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，这些因子对于将分化的细胞重编程为多能状态至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞重编程
- 干细胞生物学
- 基因递送系统
背景
- 末端分化的细胞可以重编程为多能状态。
- 这个过程克服了与胚胎干细胞相关的伦理问题。
- 四种转录因子对重编程过程至关重要。
- 棘皮病毒载体用于将这些因子递送到目标细胞中。
研究目的
- 展示从小鼠胚胎成纤维细胞生成 iPSCs 的过程。
- 提供使用棘皮病毒进行细胞重编程的详细协议。
- 强调 iPSCs 在再生医学中的意义。
使用的方法
- 转染 293 细胞以产生棘皮病毒。
- 用棘皮病毒感染小鼠胚胎成纤维细胞。
- 在胚胎干细胞条件下培养感染的细胞。
- 分离和扩增 iPSCs 克隆。
主要结果
- 成功将成纤维细胞重编程为 iPSCs。
- 在几周的培养后形成多能干细胞克隆。
- 展示从重编程细胞生成嵌合小鼠的潜力。
- 讨论处理棘皮病毒的安全协议。
结论
- 该协议提供了一种可靠的生成 iPSCs 的方法。
- 未来的应用可能会解决当前的病毒递送系统限制。
- 本研究为再生医学和细胞治疗领域做出了贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Induced pluripotent stem cell (iPSC) generation from somatic cells enables target validation and mechanistic de-risking in early discovery by providing a renewable, disease-relevant human cell source. This approach supports predictive confidence in target engagement and pathway modulation studies prior to lead identification. The inducible lentiviral system described allows temporal control of reprogramming factor expression, facilitating kinetic analysis of gene requirements and reducing ambiguity in target validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through differentiation of iPSCs into disease-relevant cell types for target engagement assays.
- Operational Value: Provides a scalable, renewable source of human cells for consistent target validation across projects.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing controlled expression of reprogramming factors to study gene dependency in reprogramming kinetics.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated biological systems suitable for assay standardization and compound screening in disease models.
- Operational Value: Enables preparation of homogeneous cell populations for reproducible, quantitative readouts in high-throughput formats.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple targets and therapeutic areas through banked iPSC lines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: iPSCs derived from patient-specific somatic cells enable disease-relevant systems for preclinical efficacy and safety testing.
- Biomarker Alignment: Facilitates identification and validation of translational biomarkers through differentiation into functional cell types.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing human-relevant data to de-risk targets before animal studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical research by providing a renewable source of disease-relevant human cells for target interrogation and compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling differentiation of iPSCs into disease-relevant cell types for target validation.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized cell populations with quantitative outputs for reliable compound screening and hit confirmation.
- Analytics: Provides measurable outputs such as colony formation kinetics, marker expression (e.g., GFP), and differentiation efficiency to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work through patient-derived iPSC models that reflect human disease genetics and pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for generating and banking iPSC lines across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through controlled, inducible reprogramming systems.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability of cell-based assays via defined, banked iPSC resources.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling early de-risking of targets using human-relevant models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on translational biomarker data and phenotypic screening outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector production, cell culture, and stem cell biology.
- Necessitates biosafety level 2+ infrastructure and training for lentivirus handling.
- Demands standardization of differentiation protocols across teams for reproducible outputs.
- Involves adaptation considerations for different genetic backgrounds and disease-relevant cell types.
- Includes practical limitations such as viral insertional mutagenesis risk and epigenetic memory in iPSC lines.
