Name: 从MEFS iPS细胞生成通过强制SOX - 2的表达，10月4，c - Myc基因和Klf4 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 学习使用慢病毒系统将小鼠胚胎成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的方法。该方案通过导入Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四种转录因子，展示细胞重编程的完整流程，为再生医学研究提供可靠技术基础。

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步骤 1：
解冻293细胞并接种以进行慢病毒生产。
<ol>
<li>在15 ml离心管中准备9 ml DMEM+培养基。</li>
<li>从液氮罐中取出一管冷冻保存的293细胞，放入37°C水浴中，直至大部分（但非全部）细胞融化。</li>
<li>将细胞从冻存管中移出，并加入第1步的15 ml离心管中。</li>
<li>以180g离心5分钟，弃去上清液。</li>
<li>用10 ml DMEM+培养基重悬细胞，转移至经明胶包被的100 mm培养皿中。将细胞置于37°C、5% CO2培养箱中培养，直至细胞融合度达到80–90%。</li>
<li>传代293细胞：用PBS洗涤细胞，吸除PBS，每10 cm培养皿加入4 ml 0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA，于37°C孵育1分钟。</li>
<li>轻敲培养皿使细胞脱落，用10 ml DMEM+培养基重悬，转移至15 ml离心管中。以180g离心5分钟，吸除上清液。</li>
<li>加入适量DMEM+培养基，通过反复吹打数次将细胞团块分散为单细胞悬液。</li>
<li>计数细胞数量，并用FP培养基调整细胞浓度至每毫升8×105个细胞。</li>
<li>按每100 mm培养皿接种8×106个细胞（10 ml）的量接种细胞，于37°C、5% CO2条件下过夜培养。</li>
</ol>
步骤 2：
用慢病毒质粒转染293细胞并收集病毒
<ol>
<li>每个10 cm培养皿使用10 µg的FUW-tetO-cDNA（Oct4、Sox2、Klf4或c-Myc）慢病毒骨架质粒，以及2.5 µg的pMD-G质粒和7.5 µg的pPax2质粒。</li>
<li>将上述三种质粒分装至一个离心管中，同时将30 µl Fugene 6转染试剂加入另一含有500 µl无血清DMEM的离心管中，轻轻弹击管壁混匀，并于室温孵育5分钟。</li>
<li>将DNA混合物逐滴加入含Fugene 6/DMEM的离心管中，轻轻弹击管壁混匀，室温孵育20分钟。</li>
<li>将DNA/Fugene 6复合物逐滴加入293细胞培养皿中，于37°C、5% CO2条件下过夜孵育。</li>
<li>次日早晨：吸除含转染试剂的培养基，加入5 ml新鲜的胚胎干细胞（ES细胞）培养基，将细胞放回培养箱继续培养。</li>
<li>转染后48小时和72小时，使用10 ml无菌一次性注射器收集293细胞的培养上清，经0.45 µm孔径的醋酸纤维素滤膜过滤后，转移至15 ml离心管中。</li>
<li>通过超速离心浓缩病毒上清。将病毒沉淀重悬于所需体积的缓冲液中，并等体积混合含有Oct-3/4、Sox2、Klf4和c-Myc慢病毒的培养基，制成混合病毒液。</li>
<li>在制备病毒的同时，将Oct4-neo/rtTA或Oct4-GFP/rtTA MEF细胞（传代数&lt;3）接种于10 cm培养皿中，使其达到约90%融合度（每皿2×106个细胞）。</li>
<li>吸除培养基，用10 ml PBS洗涤细胞一次。</li>
<li>弃去PBS，每皿加入1 ml 0.05%胰蛋白酶/0.53 mM EDTA溶液，于37°C孵育10分钟。</li>
<li>加入9 ml培养基，将细胞吹打成单细胞悬液，转移至15 ml离心管中。</li>
<li>计数细胞数量，并调整细胞浓度至8×104个细胞/ml。取10 ml细胞悬液（共8×105个细胞）接种于预先用明胶包被的10 cm培养皿中，于37°C、5% CO2条件下过夜孵育。</li>
<li>吸除成纤维细胞培养皿中的培养基，加入10 ml含病毒的培养基，于37°C、5% CO2条件下孵育4小时至过夜。</li>
<li>24小时后，吸除成纤维细胞培养皿中的培养基，加入10 ml新鲜ES细胞培养基。</li>
<li>将常规ES细胞培养基更换为含多西环素（Doxycycline）的培养基，以启动四个基因的表达；即启动重编程过程。</li>
<li>若使用Oct4-neo报告系统，则可在第6至第9天之间的任意时间开始药物筛选。</li>
<li>每天更换培养基，直至克隆生长至足够大可进行挑取。克隆通常在重编程启动约一周后首次可见，至第20天左右应可达到适合挑取的大小。</li>
</ol>
步骤 3：
挑取iPS细胞集落
挑取前一日：
<ol>
<li>将经γ射线照射的DR4小鼠胚胎成纤维细胞接种于所需数量的明胶包被的24孔板中</li>
</ol>
第1天挑取克隆：
<ol>
<li>在挑取菌落前1-2小时对平板上的菌落进行喂养。</li>
<li>向V型底96孔板的各孔中加入15 μl PBS。</li>
<li>用PBS洗涤待挑取菌落的培养皿一次，并向培养皿中加入10 ml PBS。</li>
<li>使用小型5 μl吸头（将P20移液器设定为4 μl）挑取菌落，将菌落转移至96孔板中的孔内。</li>
<li>使用多通道（12通道）移液器向每个孔中加入20 μl胰蛋白酶，上下吹打3次，于37°C孵育4分钟。</li>
<li>向经胰蛋白酶处理的菌落中加入100 μl ES培养基，上下吹打10次。使用12通道移液器每隔一个位置装一个吸头，每次将6个克隆从96孔板转移至24孔板。</li>
<li>将细胞置于37°C、5% CO2培养箱中，在24孔板中培养至细胞汇合度达到80–90%，每天用ES细胞培养基喂养一次。细胞通常在3–7天内即可准备扩增。</li>
</ol>
步骤 4
<ol>
<li>诱导多能干细胞的扩增 <ol>
<li>吸除培养基，并用 1 ml PBS 洗涤细胞。</li>
<li>完全去除 PBS，加入 0.1 ml 0.25% 胰蛋白酶/1 mM EDTA，于 37°C 孵育 10 分钟。</li>
<li>加入 0.4 ml ES 培养基，通过反复吹打将细胞悬浮为单细胞悬液。</li>
<li>将细胞悬液转移至 6 孔板中的一个孔，加入 1.5 ml ES 细胞培养基，在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育，直至细胞在 6 孔板中达到 80–90% 汇合度。此时，按以下步骤制备细胞冻存液。</li>
</ol></li>
<li>冻存液的制备 <ol>
<li>吸除培养基，并用 2 ml PBS 洗涤细胞。</li>
<li>完全去除 PBS，加入 0.5 ml 0.25% 胰蛋白酶/1 mM EDTA，于 37°C 孵育 10 分钟。</li>
<li>加入 2 ml ES 培养基，通过反复吹打将细胞悬浮为单细胞悬液。</li>
<li>将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，计数细胞数量后离心沉淀细胞。</li>
<li>弃去上清液，用 ES 培养基重悬细胞，调整浓度至每毫升含 2×106 个细胞。</li>
<li>配制 2 份 ES 细胞冻存液（含 20% DMSO 的 ES 培养基），按每管 0.5 ml 分装至冻存管中。</li>
<li>将 0.5 ml 细胞悬液转移至冻存管中，轻轻混匀。</li>
<li>将冻存管放入细胞冻存盒中，于 -80°C 过夜保存；次日转移至液氮中进行长期储存。</li>
</ol></li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

在本视频中，我们演示如何利用可诱导的慢病毒系统，从来源于 Oct4-GFP/R26-M2rtTA 和 Nanog-GFP/R26-M2rtTA 小鼠的胚胎成纤维细胞（MEFs）生成表达绿色荧光蛋白（GFP）的多能性诱导多能干细胞（iPS 细胞）。该方法在生成 iPS 细胞方面具有实用价值，因为它能够在重编程过程中调控外源基因的表达。尽管在 iPS 细胞生成过程中使用病毒会限制这些细胞在临床环境中的应用，但该方法有助于我们解答目前尚未明确的重编程机制中的一些关键生物学问题。

<table><tbody><tr><td>盐酸多西环素</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

通过强制表达 sox-2、oct-4、c-myc 和 klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

通过病毒转导 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc，可诱导已分化的鼠类细胞重获多能性（Takahashi 和 Yamanaka，2006；Wernig 等，2007；Okita 等，2007；Maherali 等，2007）。我们设计了一种重编程策略，其中这四种转录因子由多西环素（dox）诱导型慢病毒载体表达（Brambrink 等，2008）。利用这些可诱导的构建体，我们能够从小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中获得诱导性多能干细胞（iPS 细胞）。在本视频中，我们演示了生成表达这四种转录因子的可诱导慢病毒的方法，并展示了如何用这些病毒感染 MEFs 以产生 iPS 细胞。通过使用可诱导的慢病毒，可通过向培养基中添加多西环素来精确控制这四种因子的表达。与传统的逆转录病毒感染相比，该系统的优势在于能够开关基因表达，从而可详细分析重编程的动力学过程以及基因表达的需求条件。

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

分化的鼠类细胞可通过病毒转导 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 诱导产生多能性（Takahashi 和 Yamanaka，2006；Wernig 等，...）

50 多年前，人们曾提出假设，认为终末分化的细胞（如皮肤成纤维细胞）可被诱导转变为类似于胚胎干细胞的多能状态。这一概念的理论基础在于观察到几乎所有细胞类型都具有相同的遗传密码，细胞类型之间的唯一差异仅在于遗传密码的读取方式不同。将已分化细胞的细胞身份转变为多能状态的能力被称为细胞重编程。经过五年的研究，最近发现强制表达四种转录因子可将皮肤成纤维细胞重编程为多能状态。这一发现具有重大影响。除了对基础生物学具有重要意义外，它还克服了使用人胚胎干细胞进行移植治疗所面临的主要伦理争议。为了实现重编程，需要将编码四种转录因子 Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4 的四个基因进行包装，并导入慢病毒组织培养物中。随后，将含有纯化病毒的培养基加入到一个含有高密度成纤维细胞的细胞培养皿中，在该培养皿中，奇迹般的变化随之发生。其中一小部分成纤维细胞同时感染了携带这四种转录因子的病毒，并开始发生去分化。 它们的形态和增殖会发生显著变化，并开始分裂形成由多能干细胞组成的大球形细胞簇。在胚胎干细胞培养条件下培养两到三周后，可对重编程的成纤维细胞形成的克隆进行人工分离，并在体外扩增。一旦获得纯化，这些细胞可用于生成嵌合体小鼠，其中一定比例的细胞来源于去分化的成纤维细胞，并能够贡献于小鼠的不同组织。在嵌合体中，若原始成纤维细胞的遗传物质能够进入生殖系，则其遗传密码便可传递给下一代，并持续传递给后续世代。尽管目前使用病毒递送系统对临床应用仍存在障碍，但这一问题有望在短期内得到解决。在本视频中，尹实验室的成员将演示如何从小鼠胚胎成纤维细胞中诱导生成多能干细胞。大家好，我是来自马萨诸塞州剑桥市怀特黑德生物医学研究所Rudolph Jish实验室的Grant Welted。这位是同样来自Ish实验室的Tobias Bro brink。今天我们将向您展示如何通过慢病毒导入四种cDNA——OCT4、SOX2、c-Myc和Klf4，来生成诱导性多能干细胞。这些慢病毒在Tet-O-CMV启动子的驱动下表达上述四种cDNA。这使得在感染小鼠胚胎成纤维细胞后，能够精确控制这四个转基因的表达。我们今天向您展示的方案涉及慢病毒的操作，该病毒有可能感染人类细胞。您必须始终遵循安全操作规程，并在自行操作前联系您的安全管理部门。因此，让我们生成一些诱导多能干细胞（IPS细胞），以产生能够将成纤维细胞转化为IPS细胞的慢病毒。需要将293细胞与三种质粒共转染：Paks2，它提供病毒包装所需的遗传元件；病毒骨架，即带有四种CD因子之一（c-Myc、T4、Sox2、Klf4或c-Myc）的FUW tEOCMV慢病毒；以及PMDG，它表达水疱性口炎病毒（VSV）的包膜糖蛋白。这将产生致病性病毒，因此需要遵循相应的生物安全二级以上操作规程。在本视频中，我们并未实际操作具有感染性的病毒，因此未穿戴常规的防护服，也未在生物安全二级以上实验室内进行操作。转染前，将293细胞从液氮中解冻，并培养至90%融合度。随后用FU基因转染细胞，并给予48至72小时以表达病毒。此时，用0.45微米滤器过滤培养细胞的培养基，并通过超速离心浓缩病毒。浓缩病毒后，即可用于感染MES细胞，以生成iPS细胞集落。在病毒制备过程中，使用传代次数少于三次的小鼠胚胎成纤维细胞，在10厘米培养皿中培养至90%融合度，每皿细胞数约为2×10⁶。在本项实验方案中，我们使用的MES细胞表达RTTA，这对于强力霉素诱导下内源性OC4位点的GFP表达至关重要。MES 为 GFP 阴性，但真正的诱导多能干细胞（iPS 细胞）会变为 GFP 阳性。该标记提供了一种识别重编程细胞的方法。吸出成纤维细胞的培养基，用 10 mL PBS-EDTA 洗涤，弃去 PBS-EDTA，加入 5 mL 1× 胰蛋白酶，37°C 孵育 10 分钟。胰蛋白酶有助于使细胞从培养皿底部脱落。现在加入9 mL培养基，重悬细胞以形成单细胞悬液，并转移至15 mL离心管中。随后将这些细胞离心并沉淀。重悬沉淀后，对悬液中的细胞数量进行计数，并将浓度调整为每毫升8 × 10⁴个细胞。将10 mil的细胞悬液转移至经明胶包被的10厘米培养皿中。在37°C、5%CO2条件下培养过夜。过夜培养后，吸除成纤维细胞培养皿中的培养基，并向其中加入10 mil含病毒的培养基。将细胞在37°C、5%CO2条件下孵育4小时至过夜。第二天，从成纤维细胞培养皿中吸除培养基，然后加入10 mL新鲜的ESL培养基。在此阶段，细胞可进行冻存、扩增或准备启动重编程。为启动重编程，将常规ESL培养基更换为含有强力霉素的培养基，以启动四个基因的表达。将这些细胞放入培养箱中，并每天更换培养基，直到克隆生长至足够大以便挑取。克隆通常在重编程开始约一周后首次可见，到第20天左右应生长至足够大，可进行挑取。现在已过去20天，我们可以开始挑选诱导多能干细胞（IPS）克隆。在挑选克隆之前，应提前一到两个小时准备好所需数量的经明胶包被且经γ射线照射的DR四层饲养层24孔板。在挑选前，需向孔板中的克隆加入新鲜培养基进行换液，并在挑选前立即向V型底96孔板的各孔中加入50微升HEPES缓冲液。用PBS将含有待挑选克隆的培养皿洗涤一次，并向该培养皿中加入10毫升PBS。IPS细胞集落可在体视显微镜或倒置显微镜下进行挑选。用小型移液器吸头挑取菌落，并将其转移至含有 PBS 的 96 孔板中的孔内，以去除细胞团块。用移液器吸头在细胞团周围画圈，以打散团块。现在可使用多通道移液器提取重编程细胞，每孔加入 20 µL 胰蛋白酶。将液体上下吹打混匀三次，在37°C下孵育4分钟。孵育4分钟后，向三份良好的菌落中各加入100 µL ES培养基。上下吹打混匀10次，每次转移6个克隆。从96孔板转移至24孔板，使用12通道移液器，每隔一个位置使用一个吸头。随后将细胞在24孔板中置于37摄氏度、5% CO2培养箱内培养，直至细胞融合度达到80%至90%。用ES细胞培养基更换培养液，细胞通常在3至7天内可准备进行扩增。数天后，当iPS细胞达到汇合状态时，吸除培养基，加入1毫升Hanks平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞，彻底去除HBSS后，加入100微升1×胰蛋白酶溶液，于37摄氏度孵育10分钟。胰蛋白酶孵育结束后，加入400微升ESL培养基，通过上下吹打使细胞悬浮，形成单细胞悬液。将24孔板中的500微升单细胞悬液转移至6孔板的一个孔中，置于37摄氏度、5% CO2培养箱中孵育，直至细胞在6孔板中达到80%至90%融合度。此时，可选择继续扩增细胞用于Southern分析、流式分析、注射实验、畸胎瘤检测或体外分化检测。同时应记得冻存这些细胞的备份，以免丢失珍贵的iPS细胞株。我们刚刚向您展示了如何利用可诱导的抗病毒系统在小鼠胚胎成纤维细胞中诱导多能性。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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