胰蛋白酶消化与哺乳动物细胞传代培养

组织培养技术已在细胞生物学领域得到广泛应用。然而，培养的细胞需要定期维护以保持其健康状态。当细胞达到汇合状态时，必须对其进行传代培养或传代处理。

若不这样做，将导致生长减缓，最终引起细胞死亡。在本视频中，我们将演示如何培养贴壁细胞和悬浮细胞系的组织培养细胞。大家好，我是Ricky，来自美国田纳西州东部分子病理学实验室网络Dr.LAN实验室。

今天我将向您展示两种用于传代悬浮细胞和贴壁细胞的技术。要传代培养一皿细胞，我们应从一个在60毫米培养皿或25平方厘米组织培养瓶中生长至汇合的原代培养物开始，其中含有5 mL组织培养基。

首先，使用无菌移液管将原代培养中的所有培养基移除。然后，用少量37摄氏度、不含钙和镁的HBSS溶液对贴壁细胞单层洗涤一次或两次，以去除可能抑制下一步中将要加入的胰蛋白酶活性的残留胎牛血清。

接下来，向培养物中加入足量的温热胰蛋白酶EDTA溶液，使其完全覆盖贴壁细胞层。然后将培养板置于37摄氏度的加热板上孵育1至2分钟。孵育结束后，在平坦的表面上轻敲培养板底部，以使细胞脱落。

使用倒置显微镜检查培养物，确保细胞呈圆形，这表明细胞已从表面脱离。如果细胞脱离不充分，将培养板放回预热托盘中继续孵育额外一到两分钟。观察显微镜后，用完全培养基冲洗培养皿，并将悬液转移至含有2 mL完全培养基的15 mL锥形管中。

离心细胞使其沉淀，并将沉淀重悬于完全培养基中。随后，将等体积的细胞悬液加入已做好相应标记的新的培养板中。或者，也可使用血细胞计数板对细胞进行计数，并调整至所需密度，以便向每孔加入特定数量的细胞。

务必用传代日期和传代次数标记每一块培养板。加入细胞悬液后，向每个新培养物中加入1毫升新鲜培养基。随后将培养板置于37摄氏度、5% CO2的湿化培养箱中孵育。

在将细胞孵育过夜后，向培养板中加入新鲜培养基，并将其放回37摄氏度培养箱中。当培养板中的细胞生长至汇合状态时，可重复上述步骤再次传代，并根据需要持续进行传代。接下来，我们将向您展示如何对悬浮培养的细胞进行传代。

悬浮培养细胞的传代比贴壁细胞更简单。在传代悬浮培养细胞前，需每两到三天换液一次，持续培养至细胞达到汇合状态，即细胞在悬浮液中聚集成团，培养基变得浑浊。此时轻轻旋转培养瓶即可观察到该现象。

为此，从37摄氏度、5% CO2的培养箱中取出悬浮细胞培养瓶，注意不要扰动已沉降的细胞。在无菌条件下，弃去约三分之一的培养基，并加入等体积的37摄氏度预热培养基。更换培养基后，轻轻摇匀培养瓶，并将其放回37摄氏度、5% CO2的培养箱中。

如果培养液体积少于15毫升，则将培养瓶平放培养，以增强细胞与培养基的接触。否则，在无需换液的培养日可将培养瓶垂直放置。通过轻柔旋转培养瓶使细胞重新悬浮，以进行观察检查。

务必观察培养基中指示良好代谢生长的颜色变化。当细胞培养物达到融合状态（每毫升约250万个细胞）时，即可进行传代。再次说明，我们刚刚向您展示了如何对贴壁培养和悬浮培养的细胞进行传代。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的所有实验顺利成功。