细胞的冷冻、解冻及运输包装

细胞培养被广泛应用于多种研究和诊断领域。有时为了保存细胞、避免细胞衰老、降低污染风险以及减少遗传漂变的影响，需要将细胞系储存起来以备将来使用。细胞系可被冷冻以实现长期保存。

在本视频中，我们将向您展示如何冻存以单层和悬浮方式培养的细胞，以及如何再次解冻细胞以恢复其生长。大家好，我是来自东田纳西州分子病理学实验室网络Dr.LAN实验室的Ricky。今天我将向您演示如何对细胞进行长期保存的冻存操作，以及如何从液氮中解冻细胞。

为了冻存人源贴壁细胞，首先需将细胞从培养板上消化下来，操作方式与传代时相同。需要注意的是，用于冷冻保存的细胞最好处于对数生长期。待细胞脱落后，通过加入含血清的培养基或血清以终止胰酶反应，然后将细胞悬液转移至无菌离心管中，并加入两毫升冻存液。

可将来自相同来源及相同传代培养的三个或更多培养皿中的含血清完全培养基细胞合并至一个离心管中。在室温下以300至350 ×g离心5分钟。离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于10 mL、4°C的溶液中。

加入等体积的4℃冻存液至完全培养基中，充分混匀细胞，然后将试管置于冰上进行细胞计数。使用血细胞计数板，用更多冻存液稀释细胞悬液，使最终细胞浓度达到每毫升100万或1000万个细胞；此浓度适用于从接近完全汇合的25平方厘米培养瓶中冻存细胞。将细胞重悬于约3毫升冻存液中，用移液器将1毫升细胞悬液分装至已标记的2毫升冻存管中。

务必拧紧小瓶的瓶盖。将小瓶置于-80°C冰箱中1小时至过夜，然后转移至液氮储存冰箱中。悬浮培养细胞的冷冻原理与单层贴壁细胞的冷冻相似。

主要区别在于悬浮培养的细胞无需先进行胰蛋白酶消化。将细胞悬液转移至离心管中，在室温下以300至350 ×g离心10分钟。随后弃去上清液，并将沉淀重悬于4°C的冻存培养基中，细胞密度为每毫升100万至1000万个细胞。

然后将1毫升细胞悬液分装至冻存管中并进行冷冻。与单层培养物的操作相同，如前一章所示，解冻并复苏冻存的细胞。首先，从液氮冰箱中取出细胞冻存管，并立即放入37摄氏度水浴中。

持续振荡冻存管，直至培养基完全解冻，通常需要不到60秒。解冻后，在打开冻存管前，用70%乙醇擦拭管口顶部。随后将解冻的细胞悬液转移至含有2 mL温热完全培养基和20%胎牛血清的无菌离心管中，离心。

在室温下以150至200 ×g离心10分钟。此步骤可去除残留的DMSO。离心后弃去上清液，并用少量（约1 mL）含20% FBS的完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，然后将其转移至已正确标记并含有适量培养基的培养板中。通常，每5至20 mL培养基中需要加入1 mL细胞悬液。

24小时后，可将细胞放入37摄氏度的培养箱中进行培养。在5至7天后，或当培养基中的pH指示剂变色时，需确保细胞已贴壁，并更换培养基。在细胞系重新建立之前，需使用含有20%FBS的培养基维持培养。

如果复苏率极低，可能只有原始培养物中的亚群细胞在生长。在处理已知为嵌合型的细胞系时，需特别注意此情况。如果需要运输培养物，单层培养和悬浮培养均可轻松实现运输。

在25厘米组织培养瓶中，贴壁细胞生长至接近汇合状态，或悬浮细胞生长至所需密度。对于贴壁培养，首先移除培养基，然后向培养瓶中加入新鲜培养基。必须将培养瓶完全注满培养基，以防止在运输过程中因培养瓶倒置而导致细胞干燥。

对于悬浮培养物，需加入新鲜培养基以充满培养瓶。拧紧瓶盖，并用封口膜固定。将培养瓶密封于防漏塑料袋或其他防漏容器中，以防止泄漏。

如果烧瓶发生破损，应将内层容器放入第二层隔热容器中，以在运输过程中保护其免受极端温度的影响。在包装外部需贴上生物危害标识。通常情况下，培养物通过当日或隔夜快递进行运输。

我们刚刚向您展示了如何冻存和复苏人类细胞培养物，包括贴壁细胞和悬浮细胞。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的所有实验顺利成功。