冷冻，解冻，和运输包装细胞

培养的哺乳动物细胞在细胞生物学研究中被广泛使​​用。本视频介绍了冻结和存储细胞，以及如何恢复冻结的股票所需的基本技能。

细胞培养物用于各种研究和诊断应用。有时需要储存细胞系以备将来使用，以保存细胞、避免衰老、降低污染风险并最大限度地减少遗传漂变的影响。细胞系可以冷冻以进行长期储存。

在本视频中，我们将向您展示如何冷冻单层和悬浮细胞，以及如何解冻它们以便再次生长。嗨，我是东田纳西州分子病理学实验室网络 （Molecular Pathology Laboratories Network） 的 Dr.LAN 实验室的 Ricky。今天，我将向您展示如何冷冻细胞以进行长期储存，以及如何从液氮中解冻细胞。

要冷冻人类贴壁细胞，您首先要将它们从板中取出，就像包装它们一样。请记住，最好使用处于对数生长期的细胞进行冷冻保存。细胞分离后，通过添加血清或含血清的培养基终止了 tripsin 反应，将细胞悬液转移到无菌离心管中，并加入两个研磨机。

将来自同一来源的同一传代培养物的三个或更多培养皿的血清细胞的完全培养基混合到一个试管中。在室温下以 300 至 350 Gs 离心细胞 5 分钟。离心后，去除上清液，将沉淀重悬于 10 密耳的 4 摄氏度中。

完全培养基，加入等体积的 4 度冷冻培养基，充分混合细胞，然后将试管置于冰计数细胞上。使用血细胞计数器，用更多的冷冻培养基稀释悬浮液，以获得每毫升 100 万或 1000 万个细胞的最终细胞浓度，以冷冻来自几乎汇合的 25 厘米方形烧瓶中的细胞。Resus 悬浮于大约 3 mil 的冷冻培养基中，将 1 mil 等分试样的细胞悬液移液到标记的 2 mil 冷冻瓶中。

请务必拧紧样品瓶上的盖子。将样品瓶置于零下 80 度的冰箱中 1 小时至过夜，然后转移到液氮储存冰箱中。从悬浮培养物中冷冻细胞在原理上类似于从单层中冷冻细胞。

主要区别在于悬浮培养物不需要是胰蛋白酶。首先，将细胞悬液转移到离心管中，并在室温下以 300 至 350 Gs 离心 10 分钟。接下来，去除上清液，将沉淀重悬于 4 度，以 100 万至 1000 万个细胞/密耳的密度冷冻培养基。

然后将 1 mil 等分试样的细胞悬液转移到冷冻瓶中并冷冻。与上一章中演示的单层培养物一样，解冻和回收冷冻样品瓶。首先，从液氮冰箱中取出小瓶细胞，并立即将其放入 37 度的水浴中。

持续搅拌样品瓶，直到培养基解冻，这通常需要不到 60 秒。解冻后，在打开前用 70% 乙醇擦拭样品瓶顶部。然后将解冻细胞悬液转移到含有 2 mil 温热完全培养基和 20% 胎牛血清离心机的无菌离心管中。

在室温下以 150 至 200 Gs 的浓度进行 10 分钟的测定。该步骤将在离心后去除任何残留的 DMSO，弃去上清液并轻轻复苏，将少量细胞沉淀悬浮在约 1 mil 的完全培养基中，20% FBS 将其转移到含有适量培养基的正确标记的培养板中。通常，在 5 到 20 mil 的培养基中需要 1 mil 的细胞悬液。

现在，您可以将细胞放入 37 摄氏度的培养箱中，使其在 24 小时后生长。您需要确保细胞在 5 到 7 天后已粘附到板上，或者当培养基中的 pH 指示剂变色时，您需要更换培养基。您需要将培养物保存在含有 20% FBS 的培养基中，直到细胞系重新建立。

如果恢复率极低，则可能只有原始培养物的一个亚群在生长。当使用已知为马赛克的细胞系时，请特别小心这一点。如果需要运输培养物，这可以很容易地用于单层和悬浮培养。

在 25 cm 组织培养中，培养瓶细胞在单层中生长至接近共流畅度或在悬浮液中生长至所需密度。对于单层培养，首先去除培养基，然后用新鲜培养基填充培养瓶。必须将 flak 完全装满培养基，以防止培养瓶在运输过程中倒置时细胞变干。

对于悬浮液、培养物、新鲜培养基以填充培养瓶。使用香水拧紧盖子并固定到位。烧瓶密封在防漏塑料袋或其他防漏容器中，以防止溢出。

如果烧瓶损坏，则将初级容器放入二级绝缘容器中，以保护其在运输过程中免受极端温度的影响。买家危险标签贴在包裹外侧。通常，培养物在当晚或过夜运输。信使。

我们刚刚向您展示了如何冷冻和解冻贴壁细胞和悬浮细胞的人类细胞培养物。就是这样。感谢您的观看，祝您所有的实验好运。