Name: 文化髓系树突状细胞从骨髓前体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: 学习从小鼠骨髓前体细胞分离并培养髓系树突状细胞的方法。本视频演示细胞分化、流式细胞术表型分析及IL-12检测技术，适用于免疫学和疫苗研发研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JB 获得加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）研究生奖学金的支持。本项目获得了加拿大卫生研究院基金 MOP-67066 的资助。

本方案改编自 Lutz 等人1
骨髓的采集与处理
<ol>
<li>胫骨和股骨的分离：处死供体小鼠后，用70%乙醇喷洒腿部。用钝头镊子牢固夹住第一个脚踝，开始切开皮肤及下方肌肉组织，以暴露胫骨。为避免损伤骨骼，应沿胫骨平行方向缓慢切割，并保持膝关节完整。 清理股骨时，用钝头镊子夹住膝关节以固定。使用一把尖头剪刀和弯头镊子清除肌肉组织。继续向上清理，直至暴露髋关节，并能将剪刀插入股骨头与髋关节之间。在股骨与髋关节之间剪断，取出骨骼并置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
<li> 骨髓的去除：使用剪刀和弯头镊子清除骨骼上残留的肌肉组织。切除每根骨骼的骨骺端，暴露中央腔。使用装有PBS的10 mL注射器配合25G0.5”针头，将骨髓冲洗至未经组织处理的培养皿中。</li>
<li> 骨髓的处理：使用1 mL注射器推杆的橡胶端，将骨髓研磨成单细胞悬液（采用上下轻压动作，避免刮擦）。将骨髓收集至锥形离心管中，并用PBS冲洗残留的骨髓细胞。</li>
</ol>
树突状细胞的培养
<ol>
<li>用DC培养基重悬细胞，并在血细胞计数板上计数树突状细胞前体（图1）。你会观察到大小不一的细胞；其中树突状细胞前体体积最大、亮度最高。仅对这些细胞进行分类计数。取自一只6-8周龄野生型C57Bl/6小鼠的两根股骨和两根胫骨，通常可获得25-40 × 106个总树突状细胞前体。 <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="细胞计数网格显微图像；血细胞计数板用于细胞密度和活力评估。" width="218" height="217" data-altupdatedat="1787630408000"> 图1 </li>
<li>将细胞以2 × 105个树突状细胞前体/mL的密度接种于含有40 ng/mL重组小鼠GM-CSF的DC培养基中。细胞接种于未经组织培养包被的聚苯乙烯培养皿中。</li>
</ol>
添加培养基（第3天）
更换培养基时，加入含有40 ng/mL GM-CSF的全新培养基，体积为总体积的一半。
更换三分之一培养基（第6天）及成熟培养
在培养的第6天，小心移除培养基总体积的三分之一，并用新鲜的DC培养基（补充40 ng/mL GM-CSF）替换该体积。
如有需要，可使用细胞因子或Toll样受体配体刺激树突状细胞以诱导其成熟。在视频中，树突状细胞通过加入5 ng/mL CpG进行过夜刺激而实现成熟。
树突状细胞的收获
DC 培养完成（图 2）。细胞将同时存在于悬浮状态和松散贴壁于培养板上。可通过使用组织培养刮刀刮取培养皿并用 PBS 冲洗来收集贴壁细胞。在为期一周的培养和分化期间，细胞总数将增加 5–8 倍，因此预计收获 1–1.6 × 106 个细胞/mL。 <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="流式细胞术分析：CD86/CD40 表达直方图；IL-12 与 CD11c 散点图；细胞成熟情况。" width="407" height="358" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2">
图2
试剂
<ol>
<li>DC 培养基 <ol>
<li>RPMI-1640 培养基，添加以下成分：</li>
<li>10% 胎牛血清</li>
<li>100 IU/mL 青霉素</li>
<li>100 μg/mL 链霉素</li>
<li>1% L-谷氨酰胺</li>
<li>0.1% 2-巯基乙醇</li>
<li>1X 非必需氨基酸</li>
<li>1X 丙酮酸钠 </li>
</ol></li>
<li>重组小鼠 GM-CSF <ol>
<li>rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, 目录号. 315-03) </li>
</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

树突状细胞（DCs）可用于研究先天免疫与适应性免疫之间的相互作用，并可作为疫苗载体。在本视频中，我们展示了分离骨髓并在体外诱导髓系树突状细胞分化的步骤。经过培养后，这些细胞可在显微镜下观察到，包括常带有树突状突起的贴壁细胞以及非贴壁的圆形细胞。可通过抗原脉冲处理进一步操控这些树突状细胞以实现抗原呈递，或使用细胞因子和/或Toll样受体配体刺激其产生细胞因子并上调共刺激分子（综述参见 Gilboa, 2008(2)）。

<table><tbody><tr><td>重组小鼠GM-CSF</td><td>试剂</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

髓系树突状细胞（DCs）常用于研究固有免疫与适应性免疫机制之间的相互作用以及感染的早期应答。由于DCs是最强效的抗原呈递细胞，其作为疫苗载体在诱导抗原特异性免疫反应的研究中正被越来越广泛地应用。本视频中，我们演示了从小鼠供体分离胫骨和股骨、处理骨髓并在体外诱导DCs分化的实验步骤。DCs在受到刺激后其特性会发生改变：未成熟树突状细胞具有强大的吞噬能力，而成熟DCs则能够进行抗原呈递，并与CD4+和CD8+ T细胞相互作用。这种功能活性的转变伴随着细胞表面标志物的上调和细胞因子的产生。多种试剂可用于诱导DCs成熟，包括细胞因子和Toll样受体配体。本视频中，我们通过流式细胞术比较了经CpG刺激或模拟处理过夜后，两种共刺激分子CD86和CD40以及细胞因子IL-12的表达水平。在完成分化后，DCs可进一步用于疫苗载体构建，或通过体外脉冲方式使用多肽或蛋白质，或利用重组病毒载体转导，以诱导抗原特异性的免疫反应。

关键词：树突状细胞，骨髓来源树突状细胞，抗原呈递，免疫反应，体外分化，流式细胞术，CD86，CD40，IL-12，CpG

本视频展示了从小鼠骨髓中分化髓系树突状细胞的操作流程。视频中演示了小鼠胫骨和股骨的分离以及骨髓的处理过程。同时展示了细胞在分化前后形态学特征的图片，以及使用CpG诱导成熟后细胞表型和IL-12分泌情况的图示。

髓系树突状细胞（DCs）常用于研究先天免疫与适应性免疫机制之间的相互作用，以及早期免疫应答……

我叫 Jeanette Boudreaux，今天我将为您演示如何从骨髓前体细胞培养出髓系树突状细胞。髓系 DC 系在先天免疫与适应性免疫相互作用的研究中正受到越来越多的关注，同时也越来越多地被用作疫苗开发的平台。今天我们将带您完成前体细胞的分离、培养以及将其分化为树突状细胞的全过程。随后，我将向您展示细胞在成熟前后流式细胞术分析的结果。在培养期间，使用Toll样受体配体可诱导细胞在体外增殖，因此与第0天接种的前体细胞相比，细胞总数预计将增加5至8倍。我今天演示的操作步骤将在开放的实验台上进行，但为了保持无菌环境，建议您在生物安全柜或超净工作台内进行细胞培养操作。首先，您需要准备一支10毫升的注射器，配以25号针头，内装磷酸盐缓冲液（PBS），以及一把弯头镊子、一把直头镊子、一把锐利的剪刀，以及一把可用于剪切骨骼的钝头剪刀。在处死供体小鼠后，用70%乙醇喷洒其腿部以准备切口，用钝头镊子牢固夹住小鼠的脚踝，使用锐利剪刀小心地剪除腿部的皮肤和肌肉组织。从跟腱处开始，去除腿部后侧的皮肤，注意不要损伤骨骼。接下来，剪除腿部前侧的皮肤和肌肉。此步骤完成后，腿部的深层肌肉组织应已暴露。将弯镊的一臂插入胫骨与残留肌肉之间，以分离连接两者的结缔组织，并使用锐利的剪刀切断肌腱两端，从而松解并移除肌肉。以这种方式继续清理胫骨上的肌肉组织，直至骨骼完全暴露且无任何肌肉组织残留。清理股骨时，用钝头镊子夹住膝关节，再用弯头镊子小心剥离周围的肌肉组织。用剪刀剪除剩余的肌肉组织，注意不要损伤骨骼。继续清除肌肉组织，直至股骨头在髋关节内完全暴露。将骨剪沿股骨滑动，越过大转子进入髋关节。用力一次性剪断骨骼，立即将其放入盛有冰上预冷PBS的容器中。如果需要大量树突状细胞，也可取用第二只后肢。去除骨髓时，需确保骨骼末端无任何肌肉组织残留。然后使用骨剪分离膝关节处的骨骼。然后切除第一根骨的骨骺。将针头尖端插入骨的中心，用力推动注射器活塞，将骨髓冲入干净的培养皿中。持续操作直至观察到骨髓已完全被冲出，再对剩余的骨骼重复此步骤。使用1毫升注射器活塞的橡胶端，通过上下移动轻轻研磨，将骨髓组织解离成单细胞悬液。将骨髓收集至锥形离心管中。用PBS冲洗培养皿，并将冲洗液加入该离心管中。将细胞在1500 RPM条件下离心5分钟。此时，一些研究人员会加入裂解红细胞的步骤。然而，我们发现该步骤是不必要的。将沉淀重悬于DC培养基中，并用血细胞计数板进行计数。该制备物为骨髓细胞的混合物，其中一部分细胞具有分化为树突状细胞的能力。添加粒-巨噬细胞集落刺激因子（G-M-C-S-F）将促进树突状细胞的发育，但不会促进其他细胞类型的发育。因此，无需去除其他细胞。在铺板时，我们必须计数骨髓细胞，而非红细胞。这些是体积最大且最亮的细胞。例如，在此区域内，我们会计数这些细胞，但不计数这些细胞。现在开始接种细胞。进行DC培养时，我们不使

culture-of-myeloid-dendritic-cells-from-bone-marrow-precursors

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

文化髓系树突状细胞从骨髓前体

树突状细胞在次级淋巴器官中进行抗原提呈，对于启动T细胞介导的适应性免疫应答至关重要。本文中，我们展示了小鼠骨髓来源树突状细胞的培养、活化及用于双光子成像的标记方法。...

用于双光子成像的小鼠骨髓来源树突状细胞的制备

本视频介绍了一种从小鼠成年小鼠骨髓中生成树突状细胞的实验方案——树突状细胞是激活T细胞的关键抗原呈递细胞。...

骨髓来源树突状细胞的制备：一种从小鼠骨髓生成树突状细胞的方法

从共同淋巴样前体细胞体外生成浆细胞样树突状细胞

不成熟树突状细胞可被选择性地分化为耐受性或成熟树突状细胞，以调节免疫与耐受之间的平衡。本研究提供了一种从不成熟单核细胞来源的树突状细胞（moDCs）生成的方法 体外...

具有不同代谢表型的未成熟、成熟及耐受性树突状细胞的制备

在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）存在下培养的骨髓细胞可形成包含巨噬细胞和树突状细胞（DCs）的异质性细胞群。本方法重点利用主要组织相容性复合物II类分子（MHCII）和透明质酸（HA）结合能力来区分GM-CSF培养体系中的巨噬细胞与树突状细胞。该培养体系中的巨噬细胞在诸多特性上与肺泡巨噬细胞相似。...

小鼠骨髓来源的GM-CSF诱导类肺泡巨噬细胞和树突状细胞的生成与鉴定

本文展示了如何通过密度梯度离心法从人抗凝全血中分离外周血单个核细胞，再利用磁珠分选技术从中分离单核细胞。经过5天的培养后，人单核细胞可分化为未成熟树突状细胞，可用于非临床实验操作。...

从全血中生成人单核细胞来源的树突状细胞

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。...

利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

我们展示了如何利用磁珠分选与荧光激活细胞分选技术（MACS 和 FACS）相结合的方法，从小鼠骨髓中鉴定并分离出 6 个髓系祖细胞亚群。该方案可用于 体外 培养实验（甲基纤维素培养或液体培养） 体内...

从小鼠骨髓中鉴定与分离寡能性及谱系定向的髓系祖细胞

本文介绍一种经济高效的方法，通过在含10 ng/mL...

从小鼠骨髓分离和培养树突状细胞的经济高效方案

本实验方案描述了从小鼠中分离和培养骨髓来源巨噬细胞的方法。...

从小鼠中分离和培养骨髓来源的巨噬细胞

本文描述了in vitro条件下多房棘球绦虫（Echinococcus...

小细胞外囊泡的分离及其树突状细胞摄取 细粒棘球绦虫

学习从小鼠骨髓前体细胞分离并培养髓系树突状细胞的方法。本视频演示细胞分化、流式细胞术表型分析及IL-12检测技术，适用于免疫学和疫苗研发研究。

从骨髓前体细胞培养髓系树突状细胞

探索更多视频