全细胞记录的光在视网膜切片诱发兴奋性突触电流
July 2nd, 2008
录像显示，水产品虎蝾螈视网膜片全细胞电压钳记录的过程。我们示范片的准备，以及如何执行膜片钳记录在视网膜的视觉刺激。
今天我将向您展示如何准备虎蝾螈的视网膜切片以进行膜片钳记录。首先，我将准备两种显微镜载玻片。我们使用具有良好粘合剂的载玻片，以便我们可以将它们用作流体室。
在第一张幻灯片上，我放置了两条平行的真空润滑脂带。然后我拿一些滤纸，在光线的提高下将其切成矩形块。现在，我将其中一块放在润滑脂导轨上并将其向下推，使其很好地连接到滑轨上。
我对另一件作品也做了同样的事情。第二种滑梯上粘有小橡胶块。现在，我只是在块之间添加了一点真空润滑脂，我还在组织切片机中放入了一块新的剃须刀片。
最后，我列出了解剖过程中需要的工具，即两对镊子、一把剪刀和一个从头部取下眼睛以记录光诱发电流的工具。应该在红外光下进行解剖，但出于演示目的，我现在将在红外光下工作。我首先取出眼睛，将其显微镜放在一张薄纸上，然后用冰冷的振铃液润湿。
然后，我从眼球中取出多余的结缔组织，以确保它不会伤害眼睛。我总是沿着 Surface 切割。这就是你通过显微镜看到的。
接下来，我用剃须刀片在角膜上划一个小缝。为此，我用镊子按住 Down 眼睛，同时向下推角膜上剃须刀片的边缘。然后我用镊子握住角膜，同时用剪刀将其取出以取出镜片。
我在眼罩的边缘施加了一些压力，以便我可以用镊子轻松接触晶状体。接下来，我移除光圈。我用镊子抓住虹膜，同时沿着 aura serato 切割，直到只剩下眼罩。
然后我将 I 罩杯切成两块矩形。我先把它切成两半，然后修剪顶部和底部边缘。现在我拿起我之前准备的一张载玻片，拿起一块 I 杯，将其 Retina 面朝下放在滤纸上。
然后我拉起这个巩膜，这样就只有视网膜留在载玻片上。之后，我快速补充道，将我们的解决方案敲响到腔室。让我们重复第二块视网膜的过程。
但这次你可以通过显微镜观察，同时将视网膜放在滤纸上。我用左手的镊子小心地向下推巩膜。最后，我将视网膜切成 200 到 300 微米宽的切片。
接下来，我选择一个切片以用于我的实验。要选择一个好的切片，我需要将切片旋转 90 度，以便我可以看到视网膜的图层。我挑选了一个看起来完好无损的切片，并显示指示不同层的不同水平带。
为了将玻片从一张玻片移动到另一张玻片，我创建了一个振铃桥，然后小心地将玻片穿过溶液。当我放下切片时，我将其推向橡胶块，使滤纸垂直于玻璃。现在我已准备好进行膜片钳录制。
我们将细胞内溶液小份储存在冰箱中，这样我们一天就只能看到我们实际需要的量。在填充电极之前，我们过滤溶液以去除可能使电极尖端计时的小颗粒。从布尔硅酸盐毛细管玻璃中拉出贴片电极，以记录神经节细胞。
我选择了一个拉动设置，该设置将产生 2 到 4 兆欧姆之间的电极电阻。当我填充电极时，我想确保电极尖端没有气泡。用手指轻弹玻璃有助于去除气泡。
这是连接到头部载物台的电极支架。电滚筒包含一根氯化银丝。这是带有黑电桥的接地电极。
这是灌注移液器。它连接到一个八通道微灌注系统。主要灌注是重力驱动的，所以它只是一个装满 wingers 的瓶子，溶液通过这根管子进入记录室。
为了能够在黑暗中进行记录，我在显微镜的侧端口上安装了一台红外摄像头，该摄像头连接到电视屏幕。在顶部端口上，我连接了一个图像投影仪，它允许我将视觉刺激投射到视网膜上。最后是膜片钳放大器。
现在，我将视网膜切片放在显微镜下，并将接地电极添加到浴中以设置主要的大量。接下来，添加来自重力增量系统的试管。另一侧的玻璃管与真空抽吸相连，保持液位恒定。
我还确保将吸管连接到 The electro shoulder。接下来，我定位微量灌注移液器。我在浴缸中降低它 接下来是显微镜物镜。
一旦我靠近切片，我就把它向后拉一点，这样溶液就会碰到切片。当我打开灌注时，我应该看到切片像这里一样略微移动。现在让我们寻找一个好的单元格进行记录。
我们正在寻找位于切片底部的神经节细胞。现在，我在使用电极进入浴槽之前准备好电极，并添加一些正压。在显微镜下找到电极后，我将其降低到切片正上方的正下方，以贴在细胞上。
我切换到 40 倍物镜。现在我将基线电流归零并检查电极电阻。密封测试是 10 毫伏脉冲的序列，它可以帮助我查看我是否在电极和电池之间建立了紧密的密封。
现在，我降低目标电池上的电极。一旦我在细胞体上看到一个凹坑，我就从管子中释放正压，从而建立紧密的密封。现在电阻非常高，因此电流走线看起来是平坦的。
小尖峰是来自电极的电容伪影。这些可以像这样补偿，所以现在它们已经消失了。所以现在我将尝试闯入牢房。
为此，我小心地在连接到电极肩部的管子上施加小吸力脉冲，如果一切正常，您会看到电流轨迹像这样变化。您现在看到的尖峰被膜电容穿过，现在也可以补偿这是在黑暗中准备的准备。让我们看看我们是否可以记录光诱发电位的反应。
您可以在示波器上看到的轨迹是钳制在负 60 毫伏的神经节电池电压的电流响应。我们使用的光刺激是在稳定均匀的背景上呈现的亮条和暗条。我们的实验室使用软件显示一项试验的完整记录。
可以看到，这是一个 off cell 对暗条开始和亮条偏移的响应。顶部的白线表示刺激的持续时间。我们现在可以进行灌注不同药物的实验。
例如，我们可以阻断 GABAergic 和 Gly 协同抑制。等待不到一分钟后，我们通常可以开始在这里看到药物的效果。反应变得更强烈、更持久。
视网膜切片制备已广泛用于记录视网膜中不同细胞的突触电流，如果在电极溶液中加入荧光染料，则可以很容易地确认细胞类型。在解剖学上，我们在这里使用幼虫 TGA 蝾螈作为动物模型。蝾螈是冷血动物并且具有大视网膜细胞这一事实提供了有利的记录条件，但相同的技术可以应用于哺乳动物制剂。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
此视频展示了水生虎蜥蜴视网膜切片中的整细胞电压钳记录过程。它包括切片的准备和在视网膜视觉刺激过程中执行膜片钳记录。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 电生理学
- 视觉处理
背景
- 虎蜥蜴是研究视网膜生理学的模型生物。
- 整细胞电压钳是用于测量神经元中离子电流的技术。
- 理解视网膜反应对于洞察视觉处理至关重要。
- 膜片钳记录允许对膜电位进行精确控制。
研究目的
- 展示用于电生理记录的视网膜切片的准备。
- 展示膜片钳技术在活体视网膜制备中的应用。
- 探索视网膜对视觉刺激的反应。
使用的方法
- 从虎蜥蜴中制备视网膜切片。
- 使用粘性井式显微镜载玻片作为流体腔。
- 应用真空油脂固定滤纸以放置切片。
- 在视觉刺激过程中执行膜片钳记录。
主要结果
- 成功准备适合电生理分析的视网膜切片。
- 在活体制备中展示有效的膜片钳技术。
- 观察视觉刺激过程中的视网膜反应。
- 洞察视觉处理中涉及的离子电流。
结论
- 该方法提供了一种研究视网膜生理学的可靠方法。
- 膜片钳记录可以揭示关于视网膜功能的重要细节。
- 这种技术可以应用于视觉神经科学的各种研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Whole-cell patch clamp recordings in retinal slices enable precise measurement of light-evoked synaptic currents, providing mechanistic insights into visual signal transduction. This approach supports target validation in neuroscience drug discovery by linking pharmacological modulation to functional electrophysiological outputs. The retinal slice preparation offers a disease-relevant system for de-risking targets involved in retinal processing pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring light-evoked excitatory synaptic currents in retinal ganglion cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct observation of ion channel activity underlying visual processing.
- Predictive Value: Facilitates assessment of compound effects on retinal circuitry, aiding in target confidence and portfolio triage for visual neuroscience indications.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation using standardized slice preparation and perfusion.
- Quantitative Outputs: Generates reproducible, real-time current responses that enable dose-response and kinetic analysis of test compounds.
- Platform Reuse: The 8-channel perfusion system allows rapid pharmacological switching, supporting high-content screening of modulators targeting retinal pathways.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses tiger salamander retinal slices as a model to study conserved visual processing mechanisms applicable to mammalian systems.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by providing electrophysiological readouts that correlate with functional visual responses.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables mechanistic de-risking of targets by confirming on-target effects through changes in light-evoked current amplitude and kinetics.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for modulating retinal synaptic transmission.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating the contribution of specific neurotransmitter systems (e.g., GABAergic, glycinergic) to light-evoked currents.
- Screening: Delivers assay readiness through stable slice preparation and consistent baseline recordings under voltage clamp.
- Analytics: Provides quantitative measurements of current amplitude, kinetics, and pharmacological sensitivity for objective compound comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by using a preparation that mirrors key features of mammalian retinal circuitry.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiological platform for sustained investigation of visual neuroscience targets across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in retinal signal transduction pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through controlled slice mounting, perfusion, and stimulus delivery.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target engagement to functional electrophysiological outcomes, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on retinal synaptic integrity and signal fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, retinal dissection, and patch clamp technique.
- Depends on specialized instrumentation including patch clamp amplifier, perfusion system, and IR-enabled microscopy.
- Necessitates standardization of slice thickness, oxygenation, and temperature control across experiments.
- Involves adaptation considerations when translating from amphibian to mammalian retinal preparations.
- Limited by tissue viability duration and the need for skilled operators to maintain recording quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:10
Preparations for the Dissection
2:40
Dissection of the Eye
9:42
Moving Slices to the Recording Chamber
12:08
Preparation of patch Electrodes
13:21
The Recording Rig
14:09
Whole-cell Recording
17:40
Recording Light-evoked Currents
18:55
Discussion/ Conclusion
