Name: 全细胞记录的光在视网膜切片诱发兴奋性突触电流 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: 学习全细胞膜片钳记录技术，用于研究虎纹钝口螈视网膜切片在光刺激下的兴奋性突触电流反应。该方法可精确测量神经元离子电流，揭示视觉处理机制。

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&nbsp;溶液
<ul>
<li>视网膜节细胞内液（单位：mM）：100 K-葡萄糖酸盐，8 KCl，1 MgCl2，1 EGTA，10 HEPES，4 ATP，0.5 GTP，90 µM 硫罗丹明 B（用于染色），用 KOH 调节 pH 至 7.4</li>
<li>视网膜双极细胞内液（单位：mM）：90 K-葡萄糖酸盐，8 KCl，1 MgCl2，10 BAPTA，10 HEPES，4 ATP，0.5 GTP，90 µM 硫罗丹明&nbsp; B（用于染色），用 KOH 调节 pH 至 7.4</li>
<li>细胞外 Ringer 溶液（单位：mM）：112 NaCl，5 葡萄糖，5 HEPES，2 KCl，2 CaCl2，1 MgCl2，用 NaOH 调节 pH 至 7.75。该溶液无需通氧。</li>
</ul>
准备记录室
我们的记录室由一个载玻片构成，载玻片上带有粘附性凹槽，凹槽内放置从另一个粘附性凹槽切割而成的小型硅胶块，以提供组织切片的稳定性。
视网膜切片的制备
为避免感光细胞漂白，解剖应在红外光或暗红光下进行。如果需要记录视杆细胞通路的反应，则只能使用红外光（使用配备红外目镜的解剖显微镜，且关闭室内光源。对于不在显微镜下进行的操作，还应额外佩戴红外护目镜）。如果主要关注记录视锥细胞的光反应，则可使用暗红光照明的室内光源或红色手电筒。但显微镜仍应配备红外目镜。
如果光感受器输入对实验无关紧要，则可在普通室内光线下使用常规显微镜进行操作。
<ol>
<li>准备两张带有粘性硅胶小室的显微镜载玻片：在每张载玻片上制作两条平行的硅脂带（间距约0.5 cm），并在载玻片的一侧放置一片矩形滤纸，使其横跨两条硅脂带（用剃刀片的一部分轻压滤纸，确保其牢固贴附于载玻片）</li>
<li>根据既定方案处死蝾螈：将动物置于冰浴中30分钟，随后进行断头并双次穿刺脊髓</li>
<li>从蝾螈头部取出眼球，并将其置于解剖显微镜下，放置在用冰冻冷Ringer液润湿的组织纸上</li>
<li>去除眼球周围的结缔组织</li>
<li>使用剃刀片在角膜上做一个小切口</li>
<li>用镊子夹住切开的角膜，同时沿其与眼球的附着处用剪刀将其剪除</li>
<li>用镊子取出晶状体</li>
<li>用镊子夹住虹膜，并沿锯齿缘剪开以去除虹膜</li>
<li>将眼杯切成两块矩形组织片</li>
<li>取其中一块组织片，将其巩膜面朝上放置在滤纸上（确保在轻轻下压时将其展平）</li>
<li>轻柔地将巩膜从视网膜上剥离，此时视网膜应仍附着在滤纸上</li>
<li>迅速向小室内加入冰冻冷的Ringer液</li>
<li>对第二块组织片重复相同操作</li>
<li>使用安装在自制切片器中的剃刀片切割成200–300 µm宽的切片</li>
<li>用一对镊子从滤纸边缘夹起切片，将其翻转，使视网膜各层可见，然后将其放置在真空硅脂带上</li>
<li>选择一张外观无损伤且显示水平条带（代表视网膜各层）的切片（在解剖显微镜下有时难以看清各层，因为放大倍数不足；但若能辨认出部分层状结构，通常表明切片质量足够好。是否使用该切片的最终决定需在直立显微镜下观察后作出）。通过在两张载玻片之间建立Ringer液桥，将切片转移至记录室载玻片</li>
<li>确保滤纸紧贴记录室中的橡胶块，使切片不倾斜（应能同时聚焦到神经节细胞和光感受器）</li>
</ol>
将组织放置于记录装置中
<ol>
<li>将记录玻片置于显微镜下，并通过重力灌流系统用任氏液进行灌流。</li>
<li>使用配备10倍和40倍水浸物镜的直立显微镜观察标本。</li>
<li>同样，我们仅使用红外光以防止感光细胞漂白。显微镜侧端口连接一台红外摄像机，并与电视屏幕相连。</li>
</ol>
视觉刺激
视觉刺激使用Matlab中的Psychtoolbox程序生成，并通过显微镜顶部接口利用显微图像注入器（Mbf Bioscience）投射到视网膜上。采用Bits++数字视频处理器（Cambridge Research Systems）实现14位灰度等级，并同步刺激呈现与数据采集过程。本视频中使用的视觉刺激为高对比度（100%）的亮条或暗条（宽度 = 460 µm），在恒定均匀背景（亮度 = 8 × 104 光子/µm/s，尺寸：1.84 × 1.38 mm）上呈现，每刺激持续2秒。
电生理学
<ul>
<li>采用微电极拉制仪从硼硅酸盐玻璃管（外径：1.5 mm，内径：0.84 mm）中拉制膜片钳电极。记录神经节细胞时，电极阻抗为 2 至 4 MΩ；记录双极细胞时，使用较高阻抗，为 4 至 8 MΩ。</li>
<li>电压钳记录使用 Multiclamp 700A（Molecular Devices）放大器及基于 Labview 编程的实验室内部软件进行。</li>
<li>药物通过八通道灌流系统进行灌注。微灌流电极应放置于脑片附近（开启和关闭灌流时应可见组织轻微移动），但需注意避免压力过大，以防脑片从滤纸上脱落。实验过程中应始终保持微灌流开启状态（若无需给药，则灌注对照溶液），以避免因频繁开关灌流而干扰记录。</li>
</ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

优点：
<ol>
<li>所有细胞类型均可触及 </li>
<li>易于识别细胞类型，特别是当向电极液中添加荧光染料时 </li>
<li>药理学试剂可轻松到达靶细胞 </li>
<li>膜片钳技术可用于研究不同离子通道在视网膜计算中的作用。这些信息无法通过细胞外锋电位记录或尖锐电极记录获得。 </li>
<li>该技术可应用于其他动物模型 </li>
</ol>
缺点：
<ol>
<li>在切片过程中，神经突可能被切断。因此，针对空间感受野的研究可能会面临困难。 </li>
<li>与大多数用于电生理记录的离体视网膜制备方法一样，色素上皮已被去除，这可能导致感光细胞褪色。需要高强度光刺激或需在多种适应状态下研究视网膜的实验可能在此技术中遇到困难。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>解剖显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>直立显微镜</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>配备40x、10x水浸物镜、荧光滤光片和汞灯</td></tr><tr><td>P-97</td><td>微电极拉制仪</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>显微镜图像注入器</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8通道灌流系统</td><td>微灌流系统</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>数字视频处理器</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrared Oculars</td><td>其他</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>粘性硅胶小室</td><td>其他</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>直径20mm，深度1.0mm</td></tr><tr><td>膜过滤器</td><td>过滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>电极玻璃管</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>注射器过滤器</td><td>过滤器</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>4mm过滤器，.2μm尼龙膜，聚丙烯外壳</td></tr><tr><td>红外摄像机</td><td>显微镜载物摄像机</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD，B7W视频摄像机</td></tr><tr><td>苦味毒</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>士的宁</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>咪唑-4-乙酸钠盐</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>幼体虎纹蝾螈</td><td>实验动物</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

视网膜切片中光诱发的全细胞兴奋性突触电流记录

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

我们采用全细胞膜片钳技术研究视网膜中视觉信息处理所依赖的突触环路。本视频将指导您完成视网膜切片制备中单个细胞光诱导电流的全细胞记录操作。实验以水生虎纹蝾螈作为动物模型。首先介绍眼球的解剖过程，并展示如何将切片固定以进行电生理记录。当切片置于记录浴槽后，我们将演示如何实施全细胞电压钳记录。随后，向切片中的光感受器投射视觉刺激，以诱发光反应性电流。记录过程中，通过药理学试剂灌流切片，八通道灌流系统可实现不同试剂间的快速切换。视网膜切片制备被广泛应用于视网膜膜片钳记录，尤其适用于在整体铺片制备中难以触及的无长突细胞或双极细胞的研究。

全细胞膜片钳, 视网膜, 突触环路, 视觉信息处理, 光诱导电流, 视网膜切片, 虎纹蝾螈, 电生理记录, 电压钳, 视觉刺激, 药理学灌流, 八通道灌流系统, 无长突细胞, 双极细胞, 整体铺片

本视频展示了在水生虎纹蝾螈视网膜切片中进行全细胞电压钳记录的过程。我们演示了切片的制备方法，以及在视网膜接受视觉刺激期间如何进行膜片钳记录。

我们采用全细胞膜片钳技术研究视网膜中视觉信息处理的突触环路。在本视频中，我们……

今天我将向您展示如何制备虎纹蝾螈视网膜切片以进行膜片钳记录。首先，我将准备两种类型的显微镜载玻片。我们使用的载玻片上附有粘性小室，以便将其用作液体腔室。在第一块载玻片上，我放置两条平行的真空脂条带。然后取一些滤纸，将其裁剪成带有轻微凸起的矩形小片。现在，我将其中一片放在真空脂的轨道上，并轻轻按压，使其牢固地粘附在载玻片上。我对另一块也进行同样的操作。第二种载玻片上粘有小橡胶块。目前，我仅在橡胶块之间添加少量真空脂，并在组织切片机中放入一片新的刀片。最后，我准备好解剖过程中所需的工具，包括两把镊子、一把剪刀，以及用于从头部取出眼睛以记录光诱导电流的工具。解剖应在红外光下进行，但为了演示方便，我现在在可见光下操作。首先取出眼睛，并将其放置在一张用冰冻任氏液润湿的滤纸上，然后置于显微镜下。然后，我将去除眼球上多余的结缔组织，以确保不会损伤眼睛。我始终沿着表面进行切割。这便是通过显微镜所观察到的景象。接下来，我使用手术刀片在角膜上做一个小切口。操作时，用镊子固定眼球，同时将刀片边缘压在角膜上进行切割。然后用镊子夹住角膜，再用剪刀将其剪除，以取出晶状体。我轻轻按压眼杯边缘，以便用镊子更容易接触到晶状体。接下来，去除虹膜。用镊子夹住虹膜，沿睫状体切割，直至仅剩眼杯。然后将I杯切成两块矩形。我先将其对半切开，再修剪顶部和底部边缘。现在取一个之前准备好的载玻片，拿起一块I杯，将其视网膜面朝下放置在滤纸上。然后我将巩膜提起，使只有视网膜保留在载玻片上。接着，我迅速向腔室中加入并环绕加入我们的溶液。让我们对第二块视网膜重复此操作步骤。但这次您可以在显微镜下观察，同时将视网膜放置在滤纸上。我用左手持镊子，小心地按压巩膜。最后，我将视网膜切成宽度为 200 至 300 微米的切片。接下来，我选择一个切片用于实验。为了挑选一个良好的切片，我需要将切片旋转90度，以便观察视网膜的各层结构。我选择一个外观无损伤且显示出清晰水平条带的切片，这些条带代表不同的视网膜层次。为了将切片从一个载玻片转移到另一个载玻片，我先制作一个林格氏液桥，然后小心地将切片通过溶液转移。放置切片时，将其轻推至橡胶块上，使滤纸相对于玻片呈垂直方向。现在我已准备好进行膜片钳记录。我们将细胞内液分装成小份后存放在冷冻箱中，以便每天仅解冻实际所需的用量。在填充电极之前，我们会过滤溶液，以去除可能堵塞电极尖端的小颗粒。记录节细胞时，膜片电极由硼硅酸盐毛细管玻璃拉制而成。我选择一种拉制参数，使电极的电阻在2到4兆欧姆之间。填充电极时，我要确保电极尖端没有气泡。用手指轻弹玻璃管有助于去除气泡。这是连接到头端的电极架。电极滚子内含一根氯化银导线。这是带有盐桥的接地电极。这是灌流移液管，它连接到一个八通道微型灌流系统。主灌流由重力驱动，因此只需一个装满溶液的瓶子，液体便通过管道流入记录室。为了能够在黑暗中进行记录，我在显微镜的侧端

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

全细胞记录的光在视网膜切片诱发兴奋性突触电流

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小鼠视网膜神经元在暗适应脑片制备中的膜片钳记录

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学习全细胞膜片钳记录技术，用于研究虎纹钝口螈视网膜切片在光刺激下的兴奋性突触电流反应。该方法可精确测量神经元离子电流，揭示视觉处理机制。

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