视网膜切片中光诱发的全细胞兴奋性突触电流记录

今天我将向您展示如何制备虎纹蝾螈视网膜切片以进行膜片钳记录。首先，我将准备两种类型的显微镜载玻片。我们使用的载玻片上附有粘性小室，以便将其用作液体腔室。

在第一块载玻片上，我放置两条平行的真空脂条带。然后取一些滤纸，将其裁剪成带有轻微凸起的矩形小片。现在，我将其中一片放在真空脂的轨道上，并轻轻按压，使其牢固地粘附在载玻片上。

我对另一块也进行同样的操作。第二种载玻片上粘有小橡胶块。目前，我仅在橡胶块之间添加少量真空脂，并在组织切片机中放入一片新的刀片。

最后，我准备好解剖过程中所需的工具，包括两把镊子、一把剪刀，以及用于从头部取出眼睛以记录光诱导电流的工具。解剖应在红外光下进行，但为了演示方便，我现在在可见光下操作。首先取出眼睛，并将其放置在一张用冰冻任氏液润湿的滤纸上，然后置于显微镜下。

然后，我将去除眼球上多余的结缔组织，以确保不会损伤眼睛。我始终沿着表面进行切割。这便是通过显微镜所观察到的景象。

接下来，我使用手术刀片在角膜上做一个小切口。操作时，用镊子固定眼球，同时将刀片边缘压在角膜上进行切割。然后用镊子夹住角膜，再用剪刀将其剪除，以取出晶状体。

我轻轻按压眼杯边缘，以便用镊子更容易接触到晶状体。接下来，去除虹膜。用镊子夹住虹膜，沿睫状体切割，直至仅剩眼杯。

然后将I杯切成两块矩形。我先将其对半切开，再修剪顶部和底部边缘。现在取一个之前准备好的载玻片，拿起一块I杯，将其视网膜面朝下放置在滤纸上。

然后我将巩膜提起，使只有视网膜保留在载玻片上。接着，我迅速向腔室中加入并环绕加入我们的溶液。让我们对第二块视网膜重复此操作步骤。

但这次您可以在显微镜下观察，同时将视网膜放置在滤纸上。我用左手持镊子，小心地按压巩膜。最后，我将视网膜切成宽度为 200 至 300 微米的切片。

接下来，我选择一个切片用于实验。为了挑选一个良好的切片，我需要将切片旋转90度，以便观察视网膜的各层结构。我选择一个外观无损伤且显示出清晰水平条带的切片，这些条带代表不同的视网膜层次。

为了将切片从一个载玻片转移到另一个载玻片，我先制作一个林格氏液桥，然后小心地将切片通过溶液转移。放置切片时，将其轻推至橡胶块上，使滤纸相对于玻片呈垂直方向。现在我已准备好进行膜片钳记录。

我们将细胞内液分装成小份后存放在冷冻箱中，以便每天仅解冻实际所需的用量。在填充电极之前，我们会过滤溶液，以去除可能堵塞电极尖端的小颗粒。记录节细胞时，膜片电极由硼硅酸盐毛细管玻璃拉制而成。

我选择一种拉制参数，使电极的电阻在2到4兆欧姆之间。填充电极时，我要确保电极尖端没有气泡。用手指轻弹玻璃管有助于去除气泡。

这是连接到头端的电极架。电极滚子内含一根氯化银导线。这是带有盐桥的接地电极。

这是灌流移液管，它连接到一个八通道微型灌流系统。主灌流由重力驱动，因此只需一个装满溶液的瓶子，液体便通过管道流入记录室。

为了能够在黑暗中进行记录，我在显微镜的侧端口连接了一个红外相机，并将其接入电视屏幕。在顶部端口，我连接了一个图像投影仪，可用于将视觉刺激投射到视网膜上。最后是膜片钳放大器。

现在将视网膜切片置于显微镜下，并将接地电极放入浴液中以建立主要灌流。接下来，连接重力灌流系统的管道。另一侧的玻璃管连接至真空抽吸装置，以保持液面高度恒定。

我还确保抽吸管已连接到电极肩部。接下来，我放置微灌注移液管，将其降低至浴液中，并用显微镜物镜进行定位。

当我接近切片时，会稍微回拉一下，以便灌流液能够接触到切片。打开灌流后，我应该能看到切片轻微移动，就像这里所示。现在我们来寻找一个适合记录的细胞。

我们正在寻找位于切片底部的神经节细胞。现在，在将电极放入浴液之前，我会先做好电极准备，并施加一些正压。一旦在显微镜下找到电极，我便将其缓慢下降至切片正上方，以便对细胞进行膜片钳记录。

我切换到40倍物镜。现在将基线电流归零，并检查电极电阻。封接测试是一系列10毫伏的脉冲，可帮助我判断电极与细胞之间是否形成了紧密的封接。

现在，我将电极下移至靶细胞。一旦观察到细胞体上出现凹陷，便释放管路中的正压，从而形成紧密封接。此时电阻极高，电流轨迹呈现平坦状态。

这些微小的尖峰是电极产生的电容伪影。可以通过这种方式进行补偿，因此现在它们已经消失。接下来，我将尝试突破细胞膜进入细胞内。

为此，我小心地在连接电极肩部的管子上施加轻微的吸力脉冲，如果一切顺利，你会看到电流轨迹发生如下变化。现在看到的尖峰信号会受到膜电容的影响，但目前这一制备样本是在暗处制备的，可以对此进行补偿。让我们看看是否能够记录到光诱发的反应。

您在示波器上看到的波形是视网膜神经节细胞在电压钳制于负60毫伏时的电流反应。我们使用的光刺激是在稳定均匀背景下呈现的亮条和暗条。我们实验室的软件显示了一次试验的完整记录。

可以看出，这是一个离心细胞，其对暗条的出现和亮条的消失产生反应。顶部的白线表示刺激的持续时间。现在我们可以进行实验，灌注不同的药理学试剂。

例如，我们可以阻断GABA能和甘氨酸能的协同抑制作用。等待不到一分钟之后，通常就可以开始观察到此处药物的作用效果，反应变得更强且持续时间更长。

视网膜切片制备技术已广泛用于记录视网膜中不同细胞的突触电流，若在电极液中加入荧光染料，则可方便地确认细胞类型。在解剖学上，本实验采用幼体TGA蝾螈作为动物模型。由于蝾螈是变温动物且具有较大的视网膜细胞，因此提供了有利的记录条件，但该技术同样适用于哺乳动物的组织制备。