人类胚胎干细胞的染色质免疫沉淀

大家好，我是来自加利福尼亚大学河滨分校生物化学系Frank Zawa博士实验室的Stefan Burani。今天我们将向您展示染色质免疫沉淀的实验操作流程。现在就开始吧。

该实验流程从人胚胎干细胞的甲醛交联开始。交联前，将人胚胎干细胞从液氮中取出，在37摄氏度下解冻五分钟，然后用培养基洗涤。随后将细胞接种于明胶包被的六孔板中，并培养扩增两至三天。

每次免疫沉淀反应需要从 5000 万至 1 亿个细胞开始。首先将细胞裂解并在悬浮液中收集。向每份细胞悬浮液中加入新鲜的醛类交联剂至终浓度为 1%，室温孵育 10 分钟。

接下来，加入十分之一体积的1.25摩尔甘氨酸以淬灭甲醛，并孵育10分钟。用10毫升PBS重悬细胞两次，然后将细胞转移至50毫升锥形管中。在4摄氏度下，以1000转/分钟离心5分钟，使细胞沉淀成团。

离心后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 1.5 毫升裂解缓冲液中。最后，将细胞转移至 1.5 毫升微量离心管中。细胞转移完成后，在液氮中快速冷冻三次，然后使用组织研磨器破碎细胞。

细胞交联完成后，即可用于免疫沉淀，或可无限期地在零下80摄氏度冷冻保存。交联细胞后，需准备磁珠以进行后续操作。将50微升DI磁珠加入1.5毫升低吸附微量离心管中，每个免疫沉淀反应准备一管磁珠。

然后加入一毫升封闭液。现在使用磁力架收集磁珠。将离心管置于磁力架上。

让磁珠聚集在管壁一侧，大约需要15秒。可将管架倒置两次，以帮助磁珠聚集。

收集磁珠后，可使用移液器移除上清液。去除上清液后，加入 1 毫升封闭液，并通过移除磁力架上的磁铁并翻转磁力架，轻轻重悬磁珠。保持离心管位置不变，重复此操作 10 至 20 次，或直至磁珠均匀分散。

重悬后，像之前一样收集磁珠。收集完毕后，可用移液器移除上清液。使用1.5毫升封闭液重复此洗涤步骤一次。

第二次洗涤后，可将磁珠重悬于750 µL封闭液中，然后加入10 µg抗体。在我们的研究中，使用针对MLL蛋白的抗体，在4°C下孵育至少6小时或过夜，置于旋转混合仪上。在此孵育期间，您可以对交联的染色质进行超声处理，我们将在过夜孵育结束后立即演示该步骤。

移除抗体溶液，然后用一毫升溶菌酶缓冲液洗涤磁珠三次，操作方法与之前相同，使用磁力架收集磁珠。洗涤完成后，即可加入您已制备的染色质。

在开始超声处理之前，您需要先从零下80摄氏度取出冷冻的细胞沉淀，并使其融化。准备一个15毫升的锥形管用于超声处理。具体操作是在5毫升刻度处将管子切成两段，并丢弃上半部分。

可用石蜡膜或管盖覆盖离心管。在设置过程中，使用试管架固定离心管，使探针位于管底上方约0.5至1厘米处。

确保探针位于中心位置，且不接触管壁，以防止溶液起泡。现在对悬浮液进行六轮超声处理，每轮20秒。每次超声处理之间，应将每个样品置于冰水浴中，以减少起泡。

首先将输出功率设为零，然后在第一次脉冲期间手动逐渐增加至最终功率。处理一段时间后，将样品转移至1.5毫升离心管中，在4°C条件下以13,000 RPM离心10分钟，以沉淀碎片并收集上清液。

将SINA转移至新的1.5毫升离心管中。每个样本保留50微升细胞裂解液作为输入DNA。后续将用于检测共享染色质的大小。

可于 -20 °C 保存。每批超声处理的裂解液应至少保留一份输入 DNA 等分试样。现在我们已准备好对染色质进行免疫沉淀，以氨基沉淀染色质。

首先，将上一步收集的染色质（相当于5000万至1亿个细胞）加入到先前配制的50微升抗体磁珠混合液中，调整总体积至1毫升。如有必要，可使用裂解缓冲液定容并涡旋振荡以充分重悬。将磁珠与该混合物在4°C的旋转仪上孵育过夜。

孵育后，使用磁力架收集珠子，将离心管放入架子中，使珠子聚集在管壁一侧。此过程大约需要20秒。轻敲架子两次，以帮助收集全部珠子。

然后使用移液器更换吸头，在样品间转移，去除上清液。接下来需要洗涤磁珠。为此，向每个管中加入一毫升裂解缓冲液，并轻轻重悬磁珠。

可通过移除架上的磁条，将管架连同样品管一起倒置10至20次，或直至磁珠均匀重悬。随后，重新放回磁条以收集磁珠。用移液器吸去上清液。

重复此洗涤步骤三到五次。每次洗涤之间请记得更换吸头。接下来，按照上述方法，用一毫升 IP 一缓冲液洗涤磁珠四到六次。

然后，用1毫升IP2缓冲液将磁珠同样洗涤4到6次。最后，用1毫升pH为8.0的TE缓冲液将磁珠再洗涤4到6次，洗涤方法与其他洗涤步骤相同。最后一次洗涤后，去除TE缓冲液。

现在在4摄氏度下以3000 RPM离心三分钟，以去除任何残留的TE缓冲液。此时珠子已准备好用于洗脱染色质。首先加入210微升洗脱缓冲液，将离心管置于65摄氏度的恒温混匀仪中，在800 RPM条件下孵育15分钟，或最长至30分钟，以提高洗脱物的回收率。

在13,000 RPM条件下离心 beads 1分钟。离心后，移除上清液中的200微升 S 部分，转移至新管中，然后加入200微升 TE 0.0。现在我们的样品已准备好用于CROs连接，以逆转交联并沉淀DNA。

将上清液置于65摄氏度的水浴中孵育，时间至少6小时，最多15小时。此孵育步骤可在水浴中进行，以尽量减少冷凝。接下来，加入50微升的输入DNA。

在超声处理后，通过在65摄氏度下孵育，使交联的DNA逆转，此操作与洗脱液的处理方式相同。现在我们准备纯化DNA。随后使用苯酚-氯仿抽提法纯化DNA，再通过乙醇沉淀技术进行沉淀。

沉淀的DNA沉淀物重悬于水中，可于-20°C保存。如需后续使用，可将纯化的输入DNA在琼脂糖快速凝胶上电泳，以检测染色质剪切后的片段大小。理想情况下，染色体片段长度应在250至750个碱基之间。

我们刚刚向您展示了如何从人类胚胎干细胞中进行染色质免疫沉淀实验。在进行该实验时，重要的是要使用具有合适大小范围的高亲和力抗体结合染色质，并采用高严谨性的洗涤步骤。以上就是全部内容。

感谢观看，祝您的实验顺利。