Name: 小鼠卵黄囊和AGM早期造血干细胞的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-27T19:56:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学习从小鼠胚胎卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区分离早期造血干细胞的技术。本视频演示显微解剖和流式细胞分选方法，帮助研究人员获得纯净细胞群体用于造血研究。

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从小鼠卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区域分离早期造血干细胞
<ol>
<li>开始之前，必须准备好实验所需的所有试剂和工具： 
<ul>
<li>剪刀</li>
<li>4号镊子，以及5/45号外科级弯头镊子（可选）</li>
<li>带注射器的30号针头</li>
<li>35 mm&nbsp;和100 mm培养皿</li>
<li>含10%和20%胎牛血清的PBS</li>
<li>最后是胶原酶</li>
</ul>
</li>
<li>开始解剖时，需从妊娠10.5天的雌性小鼠体内取出子宫角。</li>
<li>动物按照批准的程序实施安乐死。&nbsp;我们采用二氧化碳窒息法，随后进行颈椎脱位。</li>
<li>用乙醇润湿雌鼠腹部，用剪刀切开皮肤。</li>
<li>用镊子夹住皮肤，进一步剪开腹膜。</li>
<li>打开腹腔后可观察到子宫角。用镊子固定子宫角，分别剪断远端和中央部位，以切除两侧子宫角。</li>
<li>将子宫角放入含有冷PBS（含10% FBS）的培养皿中，以去除子宫组织。</li>
<li>使用4号镊子并在显微镜下操作，小心地从每个胚胎胚体周围去除子宫内膜组织，注意避免刺破胎盘。</li>
<li>去除后，将胚胎转移至另一新鲜培养皿中，其中含有冷PBS和10% FBS。</li>
<li>小心去除胎盘组织，暴露包裹在卵黄囊中的胚胎：用镊子在胚胎包裹的卵黄囊与胎盘连接处将其剪下。&nbsp;含有卵黄动脉和部分脐带的卵黄囊可轻轻分离并置于冰上，用于后续解离。</li>
<li>将胚胎转移至一个小型培养皿中，加入极少量含10% FBS的PBS——仅需足够润湿胚胎即可，不宜过多。&nbsp;最佳液量应使胚胎在缓慢振荡培养皿时保持静止，确保解剖过程中胚胎稳定固定。</li>
<li>换用30号针头，用于切除胚胎的上部和下部，即在前肢上方和后肢下方进行切割。&nbsp;使用针头作为切割工具需要一定练习才能熟练掌握。&nbsp;可通过交叉针头进行多次微小切割来分离组织，主手持针作为引导，非主手持针进行切割。&nbsp;重复进行小切口操作&nbsp;是确保精确切割位置的关键。</li>
<li>去除胚胎的背侧部分。&nbsp;这部分组织包含体节。&nbsp;小心切除外层背侧组织，同时与主动脉（红线）保持足够距离，避免划伤。&nbsp;若划破主动脉会导致血液流失，难以清晰观察其位置。&nbsp;同样，使用针头进行微小切割&nbsp;对于维持精确的切割位置至关重要。</li>
<li>将多余组织推离视野，翻转胚胎以切除腹侧组织，同样尽可能靠近主动脉但不损伤它。&nbsp;若切割位置距离过远，则会残留腹部组织，这些可在AGM分离后进一步去除。</li>
<li>将胚胎背侧朝下放置，即背部贴紧培养皿。&nbsp;轻轻压开两侧组织，观察生殖嵴的位置。&nbsp;生殖嵴位于主动脉两侧略偏离中线处，呈管状结构。&nbsp;</li>
<li>使用与之前相同的切割技术去除多余的侧边组织，完成解剖。当胚胎一侧组织被去除后，将其翻转过来以去除另一侧残留的组织。</li>
<li>此时检查AGM是否存在可轻易去除的多余组织，但需避免损伤主动脉或性腺。&nbsp;尽可能去除多余组织有助于更好地分离干细胞群体，因为我们仅依赖少数细胞表面标志物进行纯化。</li>
<li>使用弯头镊子轻轻挑起每个AGM，放入含10% FBS的冷PBS中，待后续解离使用。</li>
</ol>
解离与流式细胞分析
<ol>
<li>为解离组织，首先将卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区（AGM）分别放入不同的离心管中。&nbsp; </li>
<li>短暂离心以沉淀组织，并弃去含10%胎牛血清（FBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）。</li>
<li>将组织重悬于含20% FBS的PBS中的0.25%胶原酶溶液中，加入足够体积以充分覆盖组织。</li>
<li>在37摄氏度下孵育组织：AGM孵育25–30分钟，卵黄囊孵育35–40分钟。&nbsp;</li>
<li>孵育结束后，轻轻吹打组织，使其解离成单细胞悬液。</li>
<li>用过量含10% FBS的PBS洗涤组织，离心收集细胞，并重悬于新鲜无菌的含10% FBS的PBS中。</li>
<li>进行流式细胞术（FACS）分析时，细胞染色按照试剂制造商的建议进行。&nbsp;我们使用BD Biosciences公司的FACSAria仪器进行流式细胞分析。&nbsp;由于胚胎细胞体积较大且较为脆弱，分选喷嘴的孔径需设置得比成年造血细胞更大（我们在实验室中也研究成年造血细胞）；同时，分选压力也需调低，低于成年造血细胞所需的条件。&nbsp;例如，在FACSAria上进行分选时，喷嘴直径为100微米，分选压力为30 psi。</li>
<li>在干细胞分析中，通过FACS从卵黄囊中分离并分选出表达cKit、CD34和CD41三种标志物的三重阳性细胞，从AGM中分离出cKit和CD34双阳性细胞。&nbsp;典型的流式图如下所示：对cKit阳性细胞同时或分别分析其CD34和CD41的表达情况。&nbsp;通常，每种标志物的阳性程度呈现梯度分布，而干细胞群体则位于阳性细胞的一个亚群中。&nbsp;这些结果表明，我们获得了良好的细胞得率，每个卵黄囊和每个AGM可获得100–300个细胞。</li>
</ol>

从小鼠卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区分离早期造血干细胞

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

在小鼠胚胎中，早期造血过程同时发生在多个器官，包括卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区。这些区域对于胚胎血液系统的建立至关重要，并最终促使干细胞迁移至胎肝，随后在骨髓中发育为成体造血干细胞。早期造血干细胞可通过胚胎显微解剖结合流式细胞术分选获得，以得到更纯的细胞群体。目前尚不清楚这些干细胞群体如何贡献于胎儿及成体干细胞库。此外，本实验室致力于研究早期干细胞在功能上如何区别于胎儿和成体造血干细胞。同时，我们对不同群体的造血干细胞进行分选，并在多种遗传模型背景下检测其功能作用。在本视频中，我们展示了常用的显微解剖操作流程，并呈现典型的流式细胞术分选结果。在成功分离这些稀有细胞群体后，可开展多种功能分析实验，包括集落形成实验和骨髓移植实验。

本视频展示了如何从胚胎中显微解剖卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区域，并利用流式细胞术分选造血干细胞。

在小鼠胚胎中，早期造血过程同时发生在多个器官，包括卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区域。这些……

在小鼠胚胎中，早期造血过程同时发生在多个器官中，包括卵黄囊、主动脉-性腺-中肾区。更重要的是，可通过胚胎的显微解剖分离这些器官，再结合流式细胞分选技术，获得更为纯化的早期造血干细胞群体。在本视频中，我们将演示常用的显微解剖操作流程，并展示典型的流式分析图结果。大家好，我是凯利·摩根（Kelly Morgan），来自霍华德·休斯医学研究所及布莱根妇女医院医学系加里·吉兰德（Gary Gilland）博士的实验室，此前在鹿特丹伊拉斯姆斯大学医学中心由伊莱恩·扎（Elaine Dza）培训。今天我将向大家展示如何通过胚胎解剖获取卵黄囊以及主动脉-性腺-中肾区域（AGM）的早期造血干细胞。我是迈克尔·凯尔（Michael Care）。同样来自Go实验室。我将向您展示如何利用facts制备GM和卵黄细胞的单细胞悬液以获取造血干细胞（HSCs）。该操作包括从E10.5小鼠胚胎中解剖早期造血器官，组织解离，以及通过facts制备单细胞悬液，从而分离造血干细胞。那么我们开始吧。在开始之前，准备好实验所需的所有试剂和工具非常重要。这些工具和试剂包括：剪刀、镊子、4号外科级弯头镊子、5号40分之1规格镊子、30号针头及注射器、35毫米和100毫米的培养皿、含10%和20%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS）以及胶原酶。开始解剖时，首先需要从怀孕的雌性个体中获取子宫组织。在受孕后10.5天，用乙醇润湿雌性个体的腹部，然后用镊子夹住皮肤，用剪刀剪开皮肤。再进行额外的切割以打开腹膜。现在打开腹腔，即可观察到子宫角。用镊子夹住子宫角，分别剪断远端和中心部位，以切除两侧子宫角。随后将子宫角置于含有冷PBS和10%FBS的培养皿中。使用4号镊子并在显微镜下操作，轻轻将每个胚胎周围的子宫内膜组织去除，注意避免刺破胎盘。将胚胎连同其胚囊结构小心取出后，置于含冷PBS和10%FDS的新培养皿中，随后仔细去除胎盘组织，暴露出包裹在羊膜囊中的胚胎。使用镊子将胚胎与包裹着卵黄囊的胎盘分离。在连接处，可轻轻将含有绒毛动脉和部分脐带的卵黄囊从胚胎上剥离，并置于冰上备用。进行解离时，将胚胎转移至一个小型培养皿中，加入极少量含10% FBS的PBS，以刚好润湿胚胎为宜，不宜过多。最佳的液体量应使胚胎保持静止，同时缓慢晃动培养板。这将在解剖过程中牢固地固定住胚胎。更换为30号针头，通过在前肢上方和后肢下方剪切，去除胚胎的上部和下部。熟悉将针头用作切割工具可能需要一些练习。通过交叉针头对组织进行解剖，重复进行小切口。使用一根针头作为引导，另一根针头进行切割操作。接下来，去除胚胎的背侧部分。该组织包含体节。操作时需轻轻切除背侧的MOS组织，同时与主动脉保持足够距离，以防止造成任何损伤。切断主动脉会导致血液流失，从而难以清晰观察其位置。因此，应根据需要使用针头进行微小切口，以确保切割位置的精确性。将多余组织推出，并翻转胚

isolation-early-hematopoietic-stem-cells-from-murine-yolk-sac

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

小鼠卵黄囊和AGM早期造血干细胞的分离

造血干细胞（HSCs）的分离与移植

本方案详细描述了从小鼠胚胎干细胞（ESC）中获得可移植的造血干细胞，并将其注射到致死剂量辐照的受体小鼠中的过程。简言之，ESC 被诱导形成拟胚体并进行分化，随后用逆转录病毒 HoxB4 感染，并与 OP9...

从小鼠胚胎干细胞中衍生造血干细胞

本文介绍了一种通过流式细胞术分析骨髓造血祖细胞分布的方法，以及高效分离高纯度造血干细胞（HSCs）的技术。该分离流程主要基于对c-Kit+细胞的磁珠富集，再通过细胞分选来纯化HSCs，用于细胞和分子水平的研究。...

小鼠造血干细胞及谱系定向祖细胞的表型分析与分离

本视频展示了一种构建人免疫系统（HIS）小鼠模型的技术。从人脐带血富集层细胞中，使用抗体包被的磁珠分离出 CD34+ 造血干细胞（HSCs）。CD34+ HSCs 在富含细胞因子的生长培养基中进行扩增，并进行冷冻保存。最后，将解冻后的 HSCs 注射到免疫缺陷小鼠幼鼠体内，以建立 HIS...

分离脐带血造血干细胞以制备人免疫系统小鼠

造血干细胞和祖细胞（HSPC）在发育过程中来源于特化的（生血性）内皮细胞，但关于部分内皮细胞如何特化为造血细胞的过程仍知之甚少。我们展示了一种基于流式细胞术的方法，可从鼠胚组织中同时分离生血性内皮细胞和HSPC。...

小鼠胚胎造血性内皮细胞的分离

本方案描述了利用培养的主动脉-性腺-中肾组织进行表达分析、检测培养物和脾脏中的集落形成单位，以及长期重建造血，以确定调控因子和信号通路对造血干细胞发育的影响。该系统已被证明是研究造血干细胞生物学特性与功能的有效体系。...

主动脉-性腺-中肾区外植体培养系统在发育性造血中的应用

本文介绍了在小鼠胚胎发育过程中对造血干细胞前体进行克隆分析的方法。我们将来自胚胎主动脉-性腺-中肾区域的单个细胞进行索引分选，结合内皮细胞共培养和移植实验，以表征单个造血前体细胞的表型特征及其植入潜能。...

利用单细胞索引分选联合内皮细胞微环境共培养技术对胚胎造血干细胞前体进行克隆分析

本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。...

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

我们介绍了一种利用Hoxb5报告系统分离长期造血干细胞（LT-HSCs）和短期造血干细胞（ST-HSCs）的逐步实验方案。...

长期与短期造血干细胞的分离方法

本研究建立了一种稳定且高效的血管壁驻留CD34+干细胞（CD34+...

磁珠分选法从鼠类分离血管壁定居的CD34+干细胞

本文介绍了可从鼠骨、骨髓、胸腺及人胸腺组织中分离基质细胞的实验方案，这些方案适用于单细胞多组学分析。...

造血器官中基质细胞的分离

学习从小鼠胚胎卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区分离早期造血干细胞的技术。本视频演示显微解剖和流式细胞分选方法，帮助研究人员获得纯净细胞群体用于造血研究。

从小鼠卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区分离早期造血干细胞

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