Name: 上丘表面上应用氟金逆行标记视网膜神经节细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: 学习使用氟金逆行标记技术研究大鼠视网膜神经节细胞的方法。该技术通过在上丘表面应用荧光染料，帮助研究人员评估细胞存活和药物效果，为神经保护和视觉通路研究提供可靠工具。

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作者感谢美国健康助手基金会国家青光眼项目提供的支持。

<ol>
<li>通过腹腔注射氯胺酮（80 mg/kg）和赛拉嗪（8 mg/kg）（体积比为2:1）对大鼠进行麻醉。手术期间涂抹无菌眼用润滑软膏，以防止角膜干燥。</li>
<li>剃除头部毛发（从眼睛至耳部水平），使用头夹将头部固定于头架上，并将门齿固定于门齿杆中。</li>
<li>用10%聚维酮碘溶液对术区进行消毒，随后使用70%酒精脱碘。</li>
<li>切开皮肤和肌肉组织，暴露颅骨及颅缝（矢状缝、冠状缝和横缝）（图1）。在切口区域滴加局部镇痛药布比卡因作为浸润处理（剂量不超过2 mg/kg）。</li>
<li>在矢状缝两侧各钻一个颅骨孔（直径2×2 mm，距离矢状缝和横缝均为0.5 mm）。操作时避免损伤脑膜及位于颅缝下方的静脉窦。 <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="颅骨缝示意图；标注了前囟、后囟、冠状缝、矢状缝和横缝。" width="469" height="317" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="活体大鼠颅骨标志"> 图1. 活体大鼠颅骨标志。 </li>
<li>使用弹簧剪小心剪开脑膜，避免撕裂。</li>
<li>使用真空泵小心吸除覆盖在上丘背侧表面的脑组织，在此过程中可观察到三个关键点：<ol>
<li>脑组织颜色由灰色变为白色，再变回灰色</li>
<li>当无色脑脊液流出时，停止吸引</li>
<li>小心地在水平方向上逐步扩大最低吸力范围，以暴露被硬脑膜覆盖的淡黄色上丘</li>
</ol></li>
<li>继续吸除上丘上方的脑组织，直至在显微镜下可直接观察到上丘的四个边缘。切除的脑皮层范围应尽可能小，以避免产生不良副作用（如运动功能障碍）。操作时注意不要触碰静脉窦。</li>
<li>使用无菌细棉条吸干骨孔内的液体，使上丘表面尽可能干燥。然后将预先用6% Fluoro-Gold浸泡过的明胶海绵薄层覆盖于上丘表面（Fluoro-Gold可被视网膜神经节细胞的轴突末梢摄取，并通过逆行运输双侧传递至其在视网膜中的胞体）。</li>
<li>用明胶海绵填塞骨孔，并使用缝合夹闭合皮肤切口。</li>
<li>将动物置于白炽灯下恢复体温并保持温暖。在上丘标记后5天内，通过饮水口服给予镇痛药布伦诺啡（100 mcg/kg）。</li>
</ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol>
<li>为何使用这种手术方法进行视网膜神经节细胞计数？ 在大鼠中，约98%的视网膜神经节细胞（RGC）已知投射至对侧上丘（SC）。将氟金（fluoro-gold）施加于SC表面，几乎可标记所有RGC，从而使我们能够专注于青光眼中最易受损的视网膜神经元。与将氟金置于横断视神经残端进行为期两天的逆行标记相比，该方法对RGC存活的干扰最小。与焦油紫（cresyl violet）染色相比，后者会染色视网膜神经节细胞层中的无长突细胞、RGC以及血管内皮细胞，而本方法对RGC具有更高的特异性。 </li>
<li>如何避免过度出血？ 首先，通过检查肌肉张力和角膜反射，确保大鼠已充分麻醉。麻醉不足将导致大量出血。其次，避免可能损伤静脉窦的操作，例如钻孔位置过于靠近缝合线，或撕裂脑膜进入静脉窦壁。第三，需特别注意保持覆盖于SC表面的硬脑膜完整，尤其是在鼻侧区域。 </li>
<li>RGC被标记需要多长时间？ 在SC标记后四天，RGC即可被标记。我通常等待七天以获得更佳的标记效果。</li>
</ol>

通过在上丘表面施加氟金逆行标记视网膜神经节细胞

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

视网膜神经节细胞（RGC）计数对于评估视网膜变性（尤其是青光眼）至关重要。可靠的RGC标记是评价任何治疗效果的基础。已知在大鼠中约98%的RGC投射至对侧上丘（SC）（Forrester and Peters, 1967）。将氟金（fluoro-gold, FG）应用于SC表面可标记几乎全部RGC，从而可针对青光眼中最易受损的视网膜神经元进行研究。FG被视网膜神经节细胞的轴突末梢摄取，并通过逆行运输双侧转移至其在视网膜中的胞体。与将FG置于横断视神经残端2天以逆行标记RGC的方法相比，该方法对RGC存活的干扰最小。与能够染色RGC、无长突细胞以及视网膜神经节细胞层中血管内皮细胞的焦油紫（cresyl violet）染色相比，该标记方法对RGC更具特异性。本视频介绍了通过将FG应用于SC表面实现RGC逆行标记的方法。手术步骤包括颅骨钻孔、吸除皮层以暴露SC，以及将明胶海绵覆盖于SC整个背侧表面。视频还提供了避免严重颅内出血和误吸SC的实用技巧。

关键词：视网膜神经节细胞，RGC计数，逆行标记，氟金，上丘，青光眼，大鼠，视网膜变性，明胶海绵，颅骨钻孔

本视频介绍了通过将荧光金（fluoro-gold, FG）施加于上丘（superior colliculus, SC）表面，逆行标记视网膜神经节细胞（RGC）的方法。该技术包括钻开颅骨、吸除皮层，并在整个SC背侧表面覆盖明胶海绵。

视网膜神经节细胞（RGC）计数对于评估视网膜变性（尤其是在青光眼中）至关重要。可靠的RGC标记是……

您好，我是来自香港大学GOSO实验室的Tu。今天我将介绍如何对大鼠进行逆行标记视网膜神经节细胞。通过将示踪染料施加于上丘表面，可对视网膜神经节细胞进行逆行标记，以便后续在制备的视网膜铺片上计数视网膜神经节细胞，从而评估细胞死亡情况或所用药物的效果。此图为视网膜至上丘的神经通路示意图。荧光示踪染料可从上丘经视束逆行运输至视网膜。通过视神经将视束交叉至眼部的视网膜。我们使用手术显微镜进行手术。欢迎使用泵吸装置，以去除CLE头固定装置背侧表面覆盖的大脑皮层，从而将红色帽状结构固定在位。用于打开颅骨并应用荧光染料FG于无毛小鼠表面的钻孔装置及正弦发生器。手术器械均经高压灭菌处理，包括精细镊子、弹簧剪、真空针、钻头和缝合夹。用于切割皮肤的手术刀片、测量用的尺子以及棉签也均处于无菌状态。我们通过注射氯胺酮和赛拉嗪凝胶对小鼠进行麻醉。剃除从眼部水平至耳部水平的毛发后，使用聚维酮碘对术区进行消毒，随后用70%酒精脱碘。然后将小鼠头部固定在颅骨固定装置上。从眼部水平开始，沿头部中线切开皮肤，直至耳部水平。这样可以充分暴露冠状缝、矢状缝、人字缝，此处为BMA，此处为人字点。在距前囟端人字缝0.5至1毫米处标记螺钉位置，然后在两侧对称地标记，以确保标记点距离缝线至少0.5毫米。然后从标记侧开始钻孔，控制钻头的速度和方向，直至缝线下方的脑膜和窦壁出现较广泛的破裂。当孔径达到约两毫米时，停止钻孔。接着再次使用另一侧的镜像视图进行确认，确保钻孔的大小和位置正确。用弹簧剪剪开脑膜，用精细镊子清除孔洞中的骨碎片。现在可以开始使用真空泵进行抽吸。脑组织的第一层是绿色物质，需连同脑膜再次剪开。然后你可以看到tcell的颜色变为白色，这些就是大脑的白质。进行抽吸时要轻柔且缓慢。现在我们又能看到灰质了。颜色变得不那么白了。你可以看到底部是灰色的。我明白了。可以看到，透明的脑脊液正在流出，这意味着我们已经到达了上丘的背侧表面。在此层面再次出现扩大的骨孔。在底部，我们可以看到覆盖在上半月小叶上的黄色硬脑膜。在此层面进行水平方向的抽吸，以避免损伤上半月小叶的内容物。然后我们可以整体开始。你会看到绿色的物质，它实际上是绿色的。然后我们来到白质部分。该组织呈白色。现在你可以清晰地看到脑脊液位于那层灰色组织下方。去除最外层的灰质，暴露出黄色的硬脑膜。小心地在各个点击器上方切开硬脑膜，然后扩大开口。尽量确保在显微镜下能够观察到点击器的整个边缘。从不同角度握住头架上的头夹，并进行一些最终的抽吸，直至可以在显微镜下直接观察到CLE的四个边缘。用细棉条吸去孔中的液体，使CLE表面尽可能牢固。取一块明胶，将其预先用6%硝酸金溶液处理过，并将其分割成若干小块。将其制成一层薄膜，大小略大于上部表面的整个背侧。小心地将其放置在顶级按压器的表面，然后是另一侧。将其放入孔内，覆盖住簇的整个表面，通过孔洞时喷射力逐渐减弱。最后，使

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