新生鼠中脑多巴胺能细胞原代分离培养

大家好，我是来自塔夫茨大学医学院药理学与实验治疗学系Emmanuel Pothos实验室的Lauren Frank。这位是Emmanuel Pothos。今天我们将向您展示一种从小鼠新生鼠中建立原代中脑多巴胺神经元细胞培养的实验方法。

该操作步骤包括以下流程：准备工具与试剂，解剖出生零至两天的啮齿类动物脑组织的中脑，分离脑组织段，并接种离散的神经元。现在让我们开始。

该实验步骤中，有多项准备工作需提前两到三周进行，以便在制备多巴胺能神经元培养物之前完成。必须提前接种胶质细胞，使其有足够时间增殖并覆盖培养皿底部。原代多巴胺能神经元将在原代神经元细胞培养前一至七天，接种于一层胶质细胞形成的单层上。在原代神经元培养前一天，移除胶质细胞的培养基，并更换为两毫升新鲜的神经元培养基。除解剖器械外，所有物品均需使用紫外光灭菌，包括12个解剖培养皿。

两个含有微型磁力搅拌子的解离管。两个瓶盖，顶部各打有两个小孔。滑动环已展开。

取出滑动环盒时，请记住保持其打开状态。所有这些工具在培养当天使用前均需用70%乙醇进行表面处理。首先，从冷冻保存中取出用于解离原代神经元溶液的所有pepane溶液组分，并使其解冻。

设置一个加热板，将烧杯中的水加热至 34 摄氏度，用于组织消化，并准备经碳氧混合气饱和的水，以对 pepane 溶液进行氧合。在消化过程中，准备 15 支无菌试管，每管加入 4 至 6 毫升无菌 PBS，用于解剖前清洗脑组织，随后置于冰上。另分装 20 至 30 毫升新鲜神经元培养基，放入培养箱中预温。

接下来，使用无菌翻口过滤装置过滤 pepane 溶液，制备解离小瓶，然后将滤液转移至解离小瓶中。使用 25 毫升带螺旋盖的小瓶，插入无菌注射器，在瓶盖上扎一个孔，并连接 0.2 微米滤器。将碳氧混合气体（carbogen）接入滤器，并用封口膜固定。将小瓶置于泡沫塑料圆盘中。

将解离管放置到位后，确保磁力搅拌子正在转动。气体已通入管内，温度已稳定在34摄氏度。将解剖显微镜移入生物安全柜中，并将解剖器械摆放在铝箔纸上。

然后铺开一张大铝箔和12张小铝箔。留下一把剪刀，用于配合铝箔进行断头操作。在通风橱外放置一个装有冰水的泡沫塑料盒。

接下来，准备麻醉剂，该麻醉剂由 0.075 毫升氯胺酮和 0.075 毫升赛拉嗪混合而成。然后获取至少 12 只 P0 至 P2 代幼崽用于 135 毫米培养皿，配备 23 毫米玻璃盖玻片。对于小鼠，需确保整窝幼崽的基因型一致。

如果基因型未知，则需要将每只动物的细胞分别接种在不同的培养皿中，并准确记录，以便将细胞与后续的基因分型结果相对应。开始解剖时，通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉第一只动物。当动物对尾部弹击测试无反应时，将其放入冰水中30秒，直至出现低温状态。

然后用70%乙醇冲洗一小片铝箔、断头剪刀和动物头部，以避免在解剖过程中污染脑组织。用剪刀断头，使头部掉落至铝箔片上，并将其移至超净台内。先用小剪刀剪开皮肤暴露颅骨，轻轻取出脑组织。沿颅骨周围360度环形剪开。

然后用镊子剥离颅骨盖。使用小刮勺将脑组织从颅腔中取出，并放入盛有冰块的15毫升离心管中。加入冷的PBS缓冲液，然后将离心管放回冰上，再取出下一个脑组织。

重复解剖操作，直至有三个大脑分别置于冰上的不同离心管中。将一个大脑连同PBS倒入第一个解剖皿中。在显微镜下，将大脑放置在硅胶密封胶制成的平台垫上作为缓冲，以保持刀片锋利。

使用移液管将脑组织片段转移至含有新鲜 PBS 的离心管中，以洗涤片段，随后再转移至 pepane 溶液中。当第一个片段加入时即启动计时器，并持续进行解剖操作，直至所有脑组织均开始消化。在 pap pain 中。

首批脑组织片段已消化约一小时。当最后一批组织片段加入后，继续消化一小时。确保 pepane 浴的温度稳定在 34 摄氏度。

开始切片步骤时，使用移液管将脑组织片段放入无菌的15毫升离心管中。尽量避免带入过多的戊烷溶液。如果发生此情况，则需去除多余的戊烷。

接着，从培养箱中加入两毫升预热的神经元培养基，洗涤组织片段。待组织片段沉降后，小心弃去尽可能多的溶液，注意不要扰动组织片段。共进行三次洗涤。

每次换液时务必更换移液器，以避免交叉污染，并使用新的移液器进行转移。在2 mL神经元培养基中开始操作。吹打25次，注意避免引入气泡。

然后让未结合的组织段静置三分钟。使用移液管尽可能收集上清液，避免扰动底部的组织段。将上清液保存在新的无菌15毫升离心管中。

使用1000微升移液器吸头重复上一步操作，然后使用200微升吸头重复操作，此时组织片段应完全解离，肉眼可见。所有步骤产生的上清液均收集至同一个15毫升离心管中。接下来即可进行细胞接种，最后使用移液管将细胞悬液反复吹打10次，以获得均匀的细胞悬液用于计数。

使用无菌的黄色移液器吸头套住镊子的每个尖端。小心地将一个载玻片环尽可能居中放置于玻璃表面。每个培养皿内的这些环将用于隔离培养皿中的一个区域，用于接种神经元。

使用移液枪头将环滑入每块培养皿的中心孔中。然后轻柔地向培养皿中加入适量体积的细胞。将细胞加入已放置在培养皿中的环的中心位置。

每次处理不同培养皿时务必更换吸头。接下来，向每皿中靠近环外侧的位置加入100 µL稀释后的GDNF溶液，以促进神经元增殖。随后，在环外侧加入有丝分裂抑制剂氟代脱氧尿苷（fluoro dioxine）或FDU，以防止胶质细胞过度生长。

移液器吸头通常需放回培养箱中，次日使用无菌移液器吸头覆盖镊子尖端，取出环状物，将培养皿放回培养箱，并尽可能减少扰动，直至实验开始。每天检查培养皿是否有污染迹象，一旦发现污染，立即移除有问题的培养皿。培养物在三周内即可用于电生理学、分子生物学实验以及免疫细胞化学检测。

现在细胞已经接种，让我们观察一些培养细胞的代表性示例。此处观察的是14天前接种的原代培养细胞。这是一个良好的培养示例，因为可以看到具有突起延伸的明显细胞体。

此外，请注意观察培养皿中是否存在霉菌或真菌生长，此类现象可能提示污染感染。我们刚刚向您展示了如何从新生啮齿类动物中制备原代分离的中脑多巴胺能细胞培养物。在进行该操作时，需牢记以下要点：保持无菌环境，仅使用出生后第0至第2天的新生动物，将其接种于健康的胶质细胞基质上，并使用胶质细胞条件培养基，同时保持一致的接种密度。

以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。