Name: 半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: 学习半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳技术，用于大规模筛选淀粉样蛋白聚合物的神经科学研究方法。该方法利用SDS抗性分离高分子量聚集体，适用于高通量分析。

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感谢 Simon Alberti 在本方案开发过程中提供的帮助。本研究得到了美国国立卫生研究院资助（GM25874）、霍华德·休斯医学研究所研究员项目（授予 S.L.）以及美国国家科学基金会博士前培训资助（授予 R.H.）的支持。

第1部分：制备凝胶
<ol>
<li>组装凝胶制备板。可使用标准的水平DNA电泳设备。对于大量样品，我们制备一块20 cm × 24 cm的凝胶板，最多可插入四把50孔梳子。确保凝胶板表面无划痕，因为划痕可能扭曲印迹图像。</li>
<li>在1X TAE缓冲液中配制1.5%琼脂糖溶液（中等或高凝胶强度，低电渗扩散，EEO值低）。溶液体积应足以完全浸没梳齿——为最大限度提高检测灵敏度，应尽可能多地加样。将混合液放入微波炉加热，直至琼脂糖完全溶解。</li>
<li>迅速从10%储存液中加入SDS至终浓度0.1%，轻轻旋转混匀。若此过程中部分琼脂糖发生凝固，可在加热板上重新溶解，注意避免煮沸。</li>
<li>将溶液倒入制备板中。用梳子轻轻拨动以去除气泡，因为气泡可能干扰后续的转膜过程。</li>
<li>待凝胶完全凝固后，取出梳子，并将凝胶放入电泳槽中。用含有0.1% SDS的1X TAE缓冲液完全浸没凝胶。</li>
</ol>
第二部分：样品制备
<ol>
<li>为了进行酵母裂解液的高通量分析，我们从在96孔板中经快速振荡过夜培养的2 ml培养物开始。本实验中，每个培养物均过表达一种目的蛋白。在分析低丰度蛋白时，必须使用更大的培养体积。 </li>
<li>以2000 RCF在室温下离心5分钟收集细胞。 </li>
<li>将细胞重悬于水中，再次离心。</li>
<li>用1 ml 原生质体化溶液重悬。在30°C下孵育约30分钟（可通过显微镜观察确认原生质体化效率）。 </li>
<li>在室温下以800 RCF离心5分钟。彻底去除上清液。</li>
<li>将沉淀的球状体重悬于100 ml裂解缓冲液中。 </li>
<li>用胶带封住模块，在高速下涡旋震荡2分钟。</li>
<li>以4000 RCF离心2分钟，沉淀细胞碎片。 </li>
<li>小心地将上清液转移至新容器中，例如96孔PCR板。 </li>
<li>如有需要，测定裂解液的蛋白浓度。</li>
<li>向样品中加入4倍浓度的上样缓冲液，配制含1倍浓度上样缓冲液的裂解液。室温孵育5分钟。</li>
<li>上样凝胶。如需要，可保留一半样品体积，煮沸后用于SDS-PAGE分析。为便于后续监测转膜程度，应加入预染SDS-PAGE蛋白标记物。此外，可使用包含大分子量蛋白的分子量标记物（例如鸡胸肌提取物）来估算所分离蛋白复合物的大小。</li>
<li>以低电压（≤ 3 V/cm 凝胶长度）电泳，直至染料前沿距凝胶末端约 1 cm。此过程需数小时。保持凝胶低温至关重要，否则低分子量蛋白（如单体）可能发生扩散，影响其检测。 </li>
</ol>
第3部分：转移
<ol>
<li>将一张硝酸纤维素膜裁剪成与凝胶相同尺寸。</li>
<li>裁剪20张GB004和8张GB002转印滤纸，使其尺寸与凝胶相同。另裁剪一张GB004作为灯芯使用，其宽度应比凝胶宽约20厘米。</li>
<li>将硝酸纤维素膜、灯芯以及4张GB002滤纸浸入1×TBS缓冲液中。</li>
<li>在塑料容器中按以下顺序组装滤纸叠层：20张干燥的GB004，然后是4张干燥的GB002，再放一张预先润湿的GB002。将硝酸纤维素膜放置在该叠层之上。</li>
<li>用清水短暂冲洗凝胶板以去除多余的电泳缓冲液。然后小心地将凝胶从制胶板上滑移到叠层上。在移动过程中，根据需要向膜上滴加TBS缓冲液。额外的缓冲液有助于防止气泡被困在凝胶下方。使用移液管进行此操作效果良好。</li>
<li>将凝胶转移至叠层后，仔细检查是否存在气泡。若发现气泡，应抬起凝胶边缘并重新加入缓冲液，直至气泡被排除。</li>
<li>将剩余的三张预先润湿的GB002滤纸覆盖在凝胶上方。用移液管在叠层表面用力滚压，确保各层之间充分接触。</li>
<li>在转移叠层两侧各放置一个盛有TBS缓冲液的抬高容器。将预先润湿的灯芯跨过叠层放置，使其两端均浸入TBS缓冲液中。</li>
<li>用另一个带有额外重量的塑料托盘覆盖整个组装好的转移叠层（例如，一个500 ml的水瓶）。</li>
<li>让转移过程持续至少三小时，或过夜进行。</li>
<li>转移完成后，膜可按标准Western印迹程序进行后续处理。</li>
</ol>
原生质球制备液 1.2 M D-山梨醇 0.5 mM MgCl2 20 mM Tris，pH 7.5 50 mM BME（现配现加） 0.5 mg/ml Zymolyase 100T（现配现加）
裂解缓冲液 100 mM Tris 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME（现用现加） 蛋白酶抑制剂（现用现加） 4X 上样缓冲液 2X TAE 20% 甘油 8% SDS 溴酚蓝（按需添加）

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-AGE 最初由 Kryndushkin 等人1报道，用于研究酵母中[PSI+]朊病毒的SDS抗性复合物，此后已广泛应用于朊病毒和非朊病毒聚集体的研究2-9。然而，蛋白质在琼脂糖凝胶电泳后转移至膜上的过程存在问题，可能导致印迹图像扭曲5。此外，最常用的浸没式电转印技术对凝胶尺寸存在实际限制，从而限制了可处理的样品数量。我们通过采用向下毛细管转移法10解决了这些问题，该方法是一种简单流程，利用一叠干燥的印迹纸将蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素膜。毛细管转移可防止图像扭曲，并便于处理大尺寸凝胶。在使用 SDD-AGE 前需考虑几个要点。对于粗提样品（例如裂解液），必须进行特异性蛋白质的免疫检测。SDD-AGE 不能完全变性目标蛋白复合物，因此待检测的蛋白质必须在淀粉样形成区域之外带有表位标签。裂解液的制备通常可按照常规 SDS-PAGE 的方法进行，但有两个重要区别。首先，必须更加注意防止蛋白酶降解。此处使用的部分变性条件不足以灭活蛋白酶，还可能使目标蛋白更易被蛋白酶降解。应使用完整的蛋白酶抑制剂混合物，浓度至少为推荐浓度的两倍。其次，应避免加热样品。如果需要全单体阴性对照（例如用于确认高分子量物种并非由共价修饰引起），可在 95°C 下孵育 10 分钟，这通常可使大多数淀粉样蛋白恢复为单体形式。

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-C extra 硝酸纤维素膜</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>GB004 印迹纸</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>GB002 (3MM Chr) 印迹纸</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖（UltraPure）</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

通过半变性去垢剂-琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚集

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

淀粉样聚集与多种蛋白质错误折叠相关病理有关，并构成了朊病毒传染性的基础。朊病毒是一类具有自我模板构象特性的蛋白质，被认为在低等生物中具有有益功能。由于淀粉样物质不溶且结构异质，其研究一直面临巨大挑战。然而，半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳（SDD-AGE）技术通过基于大小和去垢剂不溶性对淀粉样聚合物进行分离，使得此类研究成为可能。该技术目前被广泛用于检测和表征淀粉样构象变异体。本文中，我们介绍了一种适用于大规模应用的SDD-AGE改进方法，例如用于筛选新型朊病毒及其他淀粉样形成蛋白。新的SDD-AGE方法采用毛细管转移技术，提高了实验的可靠性和操作便捷性，并可适配任意尺寸的凝胶。因此，可同时处理大量来自细胞或纯化蛋白的样品，以检测其中是否存在SDS不溶性的标记蛋白构象体。

SDD-AGE 是一种用于检测和表征细胞中类淀粉样聚合物的有用技术。本文展示了一种改进方法，使该技术适用于大规模应用。

淀粉样聚集与多种蛋白质错误折叠疾病相关，并构成了朊病毒传染特性的基础，朊病毒是……

大家好，我是兰德尔·霍夫曼（Randall Hoffman），来自麻省理工学院（MIT）生物学系苏珊·利纳斯（Susan Linus）实验室的一名研究生。今天我将向大家介绍半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳（semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis，SDD-AGE）。我们实验室利用这一技术来筛选朊病毒蛋白及其他异常聚集的蛋白质。我们所采用的 SDD 年龄分析方法简单可靠，且可扩展以适应任意数量的样本。淀粉样蛋白对 SDS 变性具有极强的抗性，因此可通过 SDDH 与其他蛋白质分离。然而，仅凭 SDDH 的数据本身尚不足以确认某种物质是否为淀粉样蛋白。为此，您需要使用其他技术。鉴于这一点，让我向您演示。S-D-D-H-S-D-D-H 可使用标准的水平 DNA 电泳设备进行。首先，您需要组装凝胶制备板。装置的尺寸取决于您所拥有的样品数量。对于大量样品，我们使用 20 厘米 × 24 厘米的凝胶板，以及最多四个 50 孔的梳子。制备凝胶时，您需要中等或高凝胶强度的低EEO琼脂糖、1×TAE缓冲液以及10%的SDS储备溶液。配制1.5%的琼脂糖溶液和1×TAE缓冲液。应尽量将凝胶制备得较厚，以便能够加载更多样品并最大限度提高检测灵敏度。将混合物放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。迅速将100倍XSDS储备液加入至0.1%，并轻轻摇动混匀。如果在此步骤中有部分琼脂凝固，可将其置于加热板上重新溶解。注意避免煮沸。加入SDS后，溶液容易起泡溢出，因此需在溶液仍热时将其倒入制胶托盘中。然后用梳子去除可能在后续凝胶转移过程中产生干扰的气泡。待凝胶完全冷却并凝固后，小心移去梳子，并将凝胶放入电泳槽中。将凝胶完全浸入含有0.1% SDS的XTAE缓冲液中。现在可以准备上样。SDDH中使用的蛋白质样品制备方法与SDS-PAGE基本相同，但有两个重要区别。首先，应避免加热样品，以免使聚集体变性为蛋白质单体。其次，注意防止蛋白质降解。由于此处使用的变性条件不足以完全灭活所有蛋白酶，我们建议使用至少两倍于推荐浓度的完整蛋白酶抑制剂混合物。在本实验中，我们将使用过表达特定目的蛋白的酵母细胞裂解液。我们通常使用两毫升的过夜培养物，培养于 VWR 提供的 96 孔板中；但在分析低丰度蛋白时，必须使用更大的培养体积。将培养物在室温下以2000 RCF离心5分钟收集细胞，离心后弃去上清液，用水重悬细胞进行洗涤，再次离心。第二次离心后，弃去上清液，将细胞重悬于备用铺板溶液中。溶液中的酶可消化细胞壁，从而可在少量裂解缓冲液中高效裂解细胞。在30摄氏度下孵育30分钟。此次以800 RCF离心5分钟，收集备用的塑料细胞沉淀。彻底移除上清液，并将每个沉淀重悬于100 µL裂解缓冲液中。接着，用封口膜封住样品板，高速涡旋振荡2分钟。这有助于使所有球状塑料在4,000 ×g条件下离心2分钟，以去除细胞碎片。小心地将上清液转移至96孔PCR板中。通常情况下，我们实验室会同时分析数百个样本，因此需要使用液体处理系统来协助完成。如有需要，可测定裂解液的蛋白浓度。接下来，向样本中加入4倍体积的上样缓冲液，使裂解液中缓冲液终浓度为1倍体积，室温孵育5分钟。现在将样品加入凝胶中。如有需要，可保留一半样品用于SDS-PAGE分析。同时，上样分子量标记物，包括预染标记物以及高分子量标记物，例如鸡肌动蛋白提取物。如有需要，应保持凝胶低温以防止低分子量蛋白质扩散，因此建议在冷室中进行电泳。以低于每厘米凝胶长度3伏的低电压运行凝胶。持续电泳数小时，直至溴酚蓝迁移至距离凝胶末端约1厘米处。由于淀粉样蛋白在室温下不会被2% SDS变性，因此在2% SDS存在时，它将保持完整，而其他复合物（包括大多数非淀粉样蛋白聚集体）则会解离。因此，大多数蛋白质将以单体形式存在，并快速通过凝胶；而具有SDS抗性的高分子量淀粉样蛋白则迁移较慢。此后，凝胶即可准备进行转印。尽管可以使用多种转印方法，但我们发现毛细管转印的效果最佳。由于毛细管转印可适用于任意大小的凝胶，因此在毛细管转印中分析数百个样品是切实可行的。一叠干燥的印迹滤纸可将缓冲液从凝胶中吸出，从而使蛋白质转移到置于滤纸与凝胶之间的硝酸纤维素膜上。你需要裁剪一块硝酸纤维素膜（例如 High Bond C），其尺寸需与凝胶相同。同时，你还需要将20张GBO 04和8张GBO 02印迹滤纸裁剪至与凝胶相同的大小。GB oh four 非常厚且吸水性强，而 GBO oh two 则更薄，质地更细腻，可确保与膜更加均匀地接触。另剪取一片 GB oh four 作为灯芯使用，其宽度应比浸入凝胶的部分宽约 20 厘米。将一氧化二氮超低重量含量（nitrous UL WIC）和四片GBO oh 2以及一片XTBS放入塑料容器中，按以下顺序组装一叠纸片：20片干燥的GBO oh 4，然后四片干燥的GBO oh 2，再加一片预先润湿的GBO oh 2。将硝酸纤维素膜盖在该层叠结构上。用清水短暂冲洗凝胶模具上的凝胶，以去除多余的电泳缓冲液。然后小心地开始将凝胶从模具上滑移到层叠结构上，同时根据需要在将凝胶移出模具时用TBS冲洗膜。额外的缓冲液有助于防止气泡被困在凝胶中。在凝胶完全转移至叠层后，移液管对此步骤非常适用。需仔细检查是否存在气泡，如有则需处理。抬起凝胶边缘，重新加入缓冲液，直至气泡完全排出。将剩余的三片预先润湿的GBO oh two置于凝胶上方。通过用力滚动移液管，确保各层之间充分接触。将两个盛有 TBS 的 elevated trays 置于转膜装置两侧，将预先润湿的吸水条跨过转膜装置放置，使其两端均浸入 TBS 中。用 TBS 浸润后，将组装好的转膜装置用一个额外的塑料托盘覆盖，并压上重物（例如一瓶 500 ml 的水）。吸水条会从托盘中持续吸取缓冲液，而干燥的 blotting papers 会在数小时内将缓冲液从凝胶中逐步抽提通过。这将使蛋白质沉积到膜上，让转移过程至少持续三小时或过夜。毛细管转移完成后，可按照标准的蛋白质印迹法对膜进行后续处理。此处显示的是在一种酵母菌株中过表达的蛋白质的典型印迹结果，该菌株促使某些蛋白质形成淀粉样蛋白。可以明显看出，我们的一些候选蛋白能够很好地形成淀粉样蛋白或高分子量且SDS抗性的物质，例如此处和此处所示。然而，另一些蛋白则完全不形成聚集体，仅以单体形式存在，如这两个条带所示。此外，您还可以观察到，淀粉样蛋白聚合物的大小因蛋白质不同而有所差异，这一点可以从这两个泳道中看出。我们刚刚向您展示了一种用于分析高分子量、不溶性聚集体（如候选朊病毒的淀粉样蛋白）的简单方法。希望您喜欢本次演示，并发现该技术在淀粉样免疫原性蛋白研究中具有实用价值。感谢观看，祝您的科研工作顺利成功。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

半变性洗涤剂琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚合

我们介绍一种制备澄清的人类大脑皮层匀浆物的技术，通过SDS-PAGE进行蛋白质分离，抗原修复，并使用针对Aβ肽的抗体进行免疫印迹。采用该方案，我们能够持续在患有阿尔茨海默病病理的人类皮层组织中检测到单体及多聚体形式的Aβ。...

利用抗原表位修复法通过SDS-PAGE/免疫印迹检测人脑皮层组织匀浆中的Aβ多聚体

本视频展示了一种基于变性聚丙烯酰胺的蛋白质分离技术。该技术可根据蛋白质的分子量对其进行初步鉴定。...

基于分子量分离与可视化蛋白质的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术：用于蛋白质分析

本视频展示了基于二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳的淀粉样纤维分离方法。该技术根据淀粉样聚集体的异质性大小，实现其多态性聚集体的分离。...

二维半变性琼脂糖凝胶电泳：一种基于大小异质性分离多态性淀粉样纤维的技术

蛋白质可折叠成天然结构，也可错误折叠形成不溶性淀粉样蛋白。有利于错误折叠途径的条件可导致不同类型的淀粉样纤维形成。本文所述方法可实现天然蛋白质向淀粉样蛋白的快速转化 体外.

天然蛋白质快速生成淀粉样蛋白 体外

描述了在肺血管内皮细胞感染后产生细胞毒性淀粉样蛋白的简单检测方法 铜绿假单胞菌.

检测肺内皮细胞感染后细胞毒性淀粉样蛋白的方法 铜绿假单胞菌

此处我们采用二维半变性琼脂糖凝胶电泳来确认存在大小不均一的类淀粉样纤维，并排除纤维在凝胶电泳过程中发生解离而导致大小异质性的可能性。...

利用二维半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳验证淀粉样或类淀粉样纤维的大小异质性

本报告描述了从生物样品中分离和纯化硫酸化糖胺聚糖（GAGs）的技术，以及通过聚丙烯酰胺凝胶电泳估算其分子大小的方法。GAGs 通过与蛋白质的静电相互作用参与组织结构的构建，并影响信号传导过程。GAG...

聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染法检测糖胺聚糖

本方案描述了在使用蛋白毒性抗菌剂处理后，从大肠杆菌（Escherichia coli）中提取并可视化聚集态和可溶性蛋白质的方法。通过执行该流程，可对不同细菌菌株和/或不同处理条件下体内（in...

处理后蛋白质聚集体的提取与可视化 大肠杆菌 使用蛋白毒性应激剂

本文描述了一种重建人源γ-分泌酶的酵母系统。该系统可用于鉴定和研究影响酶活性的突变，并可用于筛选γ-分泌酶抑制剂（GSIs）。利用家族性阿尔茨海默病突变体的功能丧失特性，还可用于筛选γ-分泌酶调节剂（GSMs）。...

Saccharomyces cerevisiae 阿尔茨海默病模型用于筛选影响 γ-分泌酶介导的淀粉样蛋白 β 生成的基因、突变及化学物质

本研究概述了对GFAP及其致病突变进行生化表征的实验方法，重点在于中间丝的组装、聚集以及翻译后修饰。通过对高纯度GFAP蛋白的分析，揭示了Alexander病发病机制的相关见解，可能为研究潜在治疗靶点以及理解GFAP突变及相关疾病提供框架。...

用于胶质纤维酸性蛋白及其疾病相关变异体生化分析的实验方法

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