通过半变性去垢剂-琼脂糖凝胶电泳筛选淀粉样蛋白聚集

大家好，我是兰德尔·霍夫曼（Randall Hoffman），来自麻省理工学院（MIT）生物学系苏珊·利纳斯（Susan Linus）实验室的一名研究生。今天我将向大家介绍半变性去垢剂琼脂糖凝胶电泳（semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis，简称 SDD-AGE）。我们实验室利用这一技术来筛选朊病毒蛋白及其他淀粉样蛋白。

我们所采用的SDD年龄分析方法简单可靠，且可扩展以适应任意数量的样本。淀粉样蛋白对SDS变性具有极强的抗性，因此可通过SDDH将其与其他蛋白质分离。然而，仅凭SDDH的数据本身尚不足以确认某种物质是否为淀粉样蛋白。

为此，您需要使用其他技术。鉴于这一点，让我为您演示。S-D-D-H-S-D-D-H 可使用标准的水平 DNA 电泳设备进行。

首先，您需要组装凝胶制备板。装置的尺寸取决于样本的数量。对于大量样本，我们使用 20 厘米 × 24 厘米的凝胶板，以及最多四个 50 孔的梳子。

制备凝胶时，您需要中等或高凝胶强度的低EEO琼脂糖、1×TAE缓冲液以及10%的SDS储备溶液。配制1.5%的琼脂糖溶液和1×TAE缓冲液。应尽量将凝胶制得较厚，以便加载更多样品并最大程度提高检测灵敏度。将混合物放入微波炉中加热，直至琼脂糖完全溶解。

迅速将100倍XSDS储备液加入至0.1%，并轻轻涡旋混匀。如果在此步骤中有部分琼脂凝固，需重新在加热板上溶解。注意避免煮沸。

加入SDS后，溶液容易起泡溢出，因此需在溶液仍热时将其倒入制胶托盘中。然后用梳子去除可能在后续凝胶转移过程中产生干扰的气泡。待凝胶完全冷却并凝固后，小心移去梳子，并将凝胶放入电泳槽中。

将凝胶完全浸入含有0.1% SDS的XTAE中。现在可以准备上样。SDDH中使用的蛋白质样品制备方法与SDS凝胶电泳基本相同，但有两个重要区别。

首先，应避免加热样品，以免使聚集体变性为蛋白质单体。其次，注意避免蛋白质降解。由于此处使用的变性条件不足以完全灭活所有蛋白酶，我们建议使用至少两倍于推荐浓度的完整蛋白酶抑制剂混合物。

在本实验中，我们将使用过表达特定目的蛋白的酵母细胞裂解液。我们通常使用两毫升的过夜培养物，培养于 VWR 提供的 96 孔板中；但在分析低丰度蛋白时，必须使用更大的培养体积。

将培养物在室温下以2000 RCF离心5分钟收集细胞，离心后弃去上清液，用水重悬细胞进行洗涤，再次离心。第二次离心后，弃去上清液，将细胞重悬于备用铺板溶液中。溶液中的酶可消化细胞壁，从而可在少量裂解缓冲液中高效裂解细胞。在30摄氏度下孵育30分钟。

此次以800 RCF离心5分钟，收集备用的塑料细胞沉淀。彻底移除上清液，并将每个沉淀重悬于100 µL裂解缓冲液中。接着，用胶带封住样品块，在高速下涡旋振荡2分钟。

在4,000 RCF条件下离心两分钟，以去除所有球状塑料中的细胞碎片。小心地将上清液转移至96孔PCR板中。

通常情况下，我们的实验室会同时分析数百个样本，因此需要使用液体处理系统来协助完成工作。如有需要，可测定裂解液的蛋白浓度。接下来，向样本中加入4倍体积的上样缓冲液，使裂解液中缓冲液终浓度为1倍体积，室温孵育5分钟。

现在将样品加入凝胶中。如有需要，可保留一半样品用于SDS-PAGE分析。同时，上样分子量标记物，包括预染标记物以及高分子量标记物，例如鸡肌动蛋白提取物。

如有需要，应保持凝胶低温以防止低分子量蛋白质扩散，因此建议在冷室中进行电泳。以低于每厘米凝胶长度3伏的低电压运行凝胶。持续电泳数小时，直至染料前沿迁移至距离凝胶末端约1厘米处。

由于淀粉样蛋白在室温下不会被2% SDS变性，因此在含有2% SDS的条件下，淀粉样蛋白将保持完整，而其他复合物（包括大多数非淀粉样聚集物）则会解离。因此，大多数蛋白质将以单体形式存在，并快速通过凝胶，而具有SDS抗性的高分子量淀粉样蛋白则迁移较慢。

此后，凝胶即可准备进行转膜。尽管可采用多种转膜方法，但我们使用毛细管转膜法获得的结果最佳。由于毛细管转膜可适用于任意大小的凝胶，因此在毛细管转膜中分析数百个样品具有可行性。

一叠干燥的印迹滤纸可将缓冲液从凝胶中吸出，从而使蛋白质转移到置于滤纸与凝胶之间的硝酸纤维素膜上。你需要裁剪一块硝酸纤维素膜（例如 High Bond C），其尺寸需与凝胶相同。同时，你还需要裁剪20张GBO 04和8张GBO 02印迹滤纸，大小均与凝胶一致。

GB oh four 非常厚且吸水性强，而 GBO oh two 则更薄，质地更细腻，可确保与膜更加均匀地接触。另剪取一片 GB oh four 作为吸水垫，其宽度应比浸入的凝胶宽约 20 厘米。

将一氧化二氮超低重量含量（nitrous UL WIC）和四片GBO oh 2以及一片XTBS放入塑料容器中，按以下顺序组装一叠纸片：20片干燥的GBO oh 4，然后四片干燥的GBO oh 2，再加一片预湿润的GBO oh 2。

将硝酸纤维素膜盖在该层叠结构的上方。用清水短暂冲洗点样托盘上的凝胶，以去除多余的电泳缓冲液。然后小心地开始将凝胶从托盘滑移到层叠结构上，同时根据需要在凝胶从托盘滑出时用TBS冲洗膜。

额外的缓冲液有助于防止气泡被困在凝胶中。在凝胶完全转移至叠层后，移液管对此步骤非常适用。需仔细检查是否存在气泡，如有则必须排除。

抬起凝胶边缘，重新加入缓冲液，直至排除所有气泡。将剩余的三片预湿的GBO oh two置于凝胶上方。通过用力滚动移液管，确保各层之间充分接触。

将两个盛有 TBS 的 elevated trays 置于转移叠层两侧，将预先润湿的wick跨过叠层铺放，使其两端均浸入液体中。用 TBS 浸泡后，将组装好的转移叠层覆盖一个额外的塑料托盘，并加上一定重量（例如一瓶 500 ml 的水）。wick 会从托盘中持续吸水，而干燥的 blotting papers 会在数小时内将缓冲液从凝胶中逐步抽提通过。

这将使蛋白质沉积到膜上，让转移过程至少持续三小时或过夜。毛细管转移完成后，可按照标准的Western印迹法对膜进行处理。此处显示的是在一种酵母菌株中过表达的蛋白质的典型印迹图，该菌株促使某些蛋白质形成淀粉样蛋白。

可以明显看出，我们的一些候选蛋白能够很好地形成淀粉样蛋白或多聚体，这些多聚体具有较高的分子量且能抵抗SDS处理，如这里和这里所示。然而，另一些蛋白则完全不形成聚集体，仅以单体形式存在，例如这些和这些。此外，您还可以观察到，淀粉样蛋白聚合物的大小因蛋白质的不同而有所差异，这一点可以从这两条泳道中看出。

我们刚刚向您展示了一种用于分析高分子量、不溶性聚集体（如候选朊病毒的淀粉样蛋白）的简单方法。希望您喜欢本次演示，并将此技术应用于淀粉样免疫原性蛋白的相关研究中。感谢观看，祝您的科研工作顺利成功。