双整装原位杂交技术在早期鸡胚
October 27th, 2008
本视频演示了原位杂交的方法，其中2个不同的基因的时空表达模式可以在年轻的鸡胚显示2色整装。这种方法最初是由大卫威尔金森，多明戈斯恩里克，菲尔英厄姆和大卫ISH - Horowicz。
该程序从胚胎的固定、甲醇和蛋白酶 K 处理开始，然后用探针 1 diggen 或 dig 和 probe 孵育过夜。在与 dig 碱性磷酸酶发生显色反应后，将两个异硫氰酸荧光素或 ZI 胚胎与 dig 抗体一起孵育。活动失活并孵化胚胎。
使用 FSE 抗体与 Zi 进行显色反应并固定胚胎。嗨，我是来自休斯顿德克萨斯农工大学环境与基因组医学中心 Rick Finnel 实验室的 Delphine。今天我们将向您展示在雏鸡胚胎中进行两种着色剂原位杂交的程序。
我们在实验室中使用该程序来分析抗癫痫药物对胃和神经基因的影响。那么让我们开始吧 要对雏鸡胚胎进行原位杂交，首先用镊子敲击蛋壳并取出蛋壳碎片，从而打开鸡蛋。用镊子取出厚白蛋白，用粗镊子倾斜蛋黄袋，使胚胎用细剪刀朝上。
在胚胎周围切一个方形的蛋黄袋。用勺子从蛋黄中取出胚胎，放入装有冰块的盘子中。解剖显微镜下的冷 dey PBS 小心地去除膜和 ylk，并将胚胎转移到含有冰的新鲜培养皿中。
冷 dey PBS 用镊子压住胚胎，并在通风橱中吸出 dey PBS。用 dey PBS 中的 4% 多聚醛替换它，并让胚胎在 4 摄氏度下固定过夜。胚胎固定后，吸出固定液并作为化学废物妥善处理。
使用钝端微毛细管针或显微解剖刀在头部和心脏腔中穿刺冰冷的 dey PBS 填充培养皿。防止探针捕获。将胚胎放入含有 0.1%吐温 20 的 DEP CPBS 中，然后将胚胎在甲醇系列洗涤中脱水，分别在 25%、50%、75% 和 100% 甲醇的 PBT 溶液中洗涤 10 分钟。
重复 100% 甲醇洗涤。胚胎现在可以在零下 20 摄氏度的甲醇中储存。在 20 mL 玻璃闪烁瓶中。
要进行原位杂交，首先需要对胚胎进行再水合。为此，在 PBT 中用 75%50% 和 25% 甲醇洗涤胚胎各 10 分钟。最后，洗涤两次，每次 10 分钟。
在 PBT 中，从小瓶中取出 PBT 溶液，并替换为每毫升 5 微克的蛋白酶 K 溶液。每瓶 3 毫升。轻轻滚动样品瓶，确保所有内容物都暴露在蛋白酶 K 溶液中。
在蛋白酶 K 溶液中放置 1 到 5 分钟，具体取决于胚胎阶段。同时，使用不含 RNA 的移液管制备冰冷的固定液，去除蛋白酶 K 溶液并加入 2 毫升固定液。立即将样品瓶放在冰上整整 20 分钟。
接下来，在室温下在突变器上洗涤胚胎。在 PBT 中洗涤两次 10 分钟，然后在 PBT 中用 50% 杂交缓冲液洗涤一次 10 分钟。然后在 100% 杂交缓冲液中洗涤一次，将胚胎在 2 毫升杂交缓冲液中孵育 4 至 5 小时。
在 65 摄氏度。胚胎现在已准备好与探针 dig 杂交，支持材料中描述了 fitzy 耦合探针合成。预期产生强信号的探针应与含有 FSE 的核苷酸合成，而较弱的探针应与含有核苷酸的 DIG 合成。
使用 2 mL 样品瓶在杂交缓冲液中预警告探针。从胚胎中取出杂交缓冲液，并立即用探针溶液替换杂交缓冲液。重要的是不要让胚胎在 16 摄氏度下干燥孵育 65 小时。
探针杂交步骤后，用杂交缓冲液替换探针溶液。在 65 摄氏度下进行两次 30 分钟的洗涤，然后在 65 摄氏度下再次在杂交、缓冲液和马来酸缓冲液的一对一混合物中洗涤 15 分钟。完成此步骤后，您不再需要使用不含 RNA 的条件。
现在，您可以进行 dig 颜色反应，然后进行 Fitz 颜色反应。要首先进行抗体杂交和显色反应，请在马来酸缓冲液中洗涤胚胎两次，每次 20 分钟。然后在马来酸缓冲液中用 2% VBR 洗涤 1 小时。
最后，在封闭缓冲液中观察 5 小时在封闭缓冲液中稀释抗体 1 至 2000，并将胚胎在该溶液中在 4 摄氏度的突变体上孵育过夜。第二天，在马来酸缓冲液中洗涤 3 次，每次 10 分钟，然后在马来酸缓冲液中洗涤 3 次，每次 1 小时。洗涤两次，每次 20 分钟。
在 NTMT 中，将 200 微升 N-B-T-B-C-I-P 底物添加到 10 毫升中。NTMT 立即从装有胚胎的小瓶中取出 NTMT，并替换为 1 至 2 毫升。N-B-T-B-C-I-P 缓冲区的地方。
20 分钟后监测颜色反应，此后每隔 20 分钟监测一次。当蓝色适当发展时，在 PBS 中洗涤胚胎 10 分钟。然后用 PBS 中的 4% 多聚甲醛替换 PBS。
在 4 摄氏度下固定过夜。将胚胎转移到新的 syn 安装瓶中，在 PBT 中洗涤两次，每次 10 分钟，然后在马来酸缓冲液中洗涤两次，每次 10 分钟。将胚胎在马来酸缓冲液中于 65 摄氏度孵育 30 分钟。
现在是时候进行第二次抗体孵育和显色反应了。为了检测我们的第二个 fit e 标记的探针，在马来酸缓冲液中洗涤胚胎两次，每次 10 分钟。在马来酸缓冲液中，在 2% BBR 中浸泡 1 小时。
然后在封闭缓冲液中 5 小时，在封闭缓冲液中将碱性磷酸酶偶联的抗 FTSE 抗体稀释 1 至 500，并在 4 摄氏度下将胚胎在该溶液中孵育过夜。第二天早上在马来酸缓冲液中进行 3 次 10 分钟的洗涤，然后在马来酸缓冲液中进行 3 次 1 小时的洗涤。接下来，洗涤两次，每次 20 分钟。
在 Tris HCL 中，根据制造商的方案，在 Tris HCL 中制备 5 毫升载体红工作溶液。立即从样品瓶中取出 triss HCL，并更换为载体红色缓冲液。将样品瓶置于黑暗中。
30 分钟后监测颜色反应，此后每隔 30 分钟，在红色形成后，将胚胎转移到 PBS 中。您终于准备好修复和处理胚胎了。将它们转移到含有 4% 多聚甲醛的固定皿中，并在室温下固定 20 分钟或在 4 摄氏度下过夜。
在 PBS 中洗涤两次，每次洗涤 10 分钟，以便进行摄影处理。将胚胎转移到 PBS 中的 20% 甘油中。这将使胚胎半透明，以便进行蜡切片。
将胚胎转移回 PBS 中，洗涤两次，每次 10 分钟，在甲醇系列中脱水，每次 10 分钟，用丙醇置换甲醇并孵育 3 分钟。取出丙醇，用 1 2 3 4 tetra hydro nap filine 更换 20 分钟，然后用 histo clear，两次洗涤，每次 1 小时。更换为组织透明液和蜡的一对一混合物，并在 60 摄氏度下孵育 1 小时。
用蜡代替此溶液，并进行组织学处理。这个胚胎在袜子中标有 digo 氧，两个蓝色探针和一个红色的 fitzy delta one 探针。第一次颜色反应揭示了袜子的表达模式。二。
在 Dr.Robin 水平徽章 sox 的实验室中开发的神经板标记物，两个阳性细胞在与 N-B-T-B-C-I-P 反应后呈蓝色。然后处理相同的胚胎进行第二次颜色反应，这揭示了 delta one 的表达模式。在 Domingo Enrique 博士的实验室中开发的节段板标记物 Delta one 阳性细胞在与载体红色反应后呈红色。
该胚胎用 PAC 中的 digo、蓝色的 six 探针和红色的 fitzy SHH 探针标记。第一个颜色反应揭示了 PAC six 的表达模式，PAC six 是 Martin Goulding Pac 博士实验室开发的神经折叠和发育体节的标志物。六个阳性细胞在与 N-B-T-B-C-I-P 反应后呈蓝色。
第二种颜色反应揭示了 Cliff Tabban 博士实验室开发的神经管腹侧中线的 SHHA 标志物的表达模式。SHH 阳性细胞在与载体红色反应后呈红色。我们刚刚向您展示了如何在 chicken ry 中执行 color 和 c 杂交。
执行此程序时，请务必记住使用深度 C 处理的溶液以及高压灭菌器、pfas 和无菌 vi。为了尽量减少与 RNA 的接触，分第 3 步到第 5 步。就是这样。
感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
这段视频展示了2色整体原位杂交，一种在幼鸡胚胎中可视化两种不同基因的时空表达模式的技术。该过程包括固定、甲醇和蛋白酶K处理以及使用特定探针的孵化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 基因表达
背景
- 整体原位杂交可以使胚胎中的基因表达可视化。
- 这种方法最初由该领域的知名研究人员引入。
- 了解基因表达模式对发育生物学研究至关重要。
- 鸡胚是此类研究的模式生物。
研究目的
- 同时可视化两个基因的表达模式。
- 为该领域的研究人员提供详细的方法。
- 增强对胚胎发育过程中基因相互作用的理解。
使用的方法
- 鸡胚的固定。
- 甲醇和蛋白酶K处理。
- 孵育二氧杂嘌呤标记的探针。
- 使用抗体进行颜色反应以实现可视化。
主要结果
- 成功可视化了胚胎中的基因表达模式。
- 展示了2色方法的有效性。
- 清晰区分了基因表达位置。
- 在发育生物学研究中的潜在应用。
结论
- 2色整体原位杂交是一种有价值的技术。
- 该方法可应用于基因表达的各种研究。
- 进一步的研究可以扩大其在发育研究中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables simultaneous visualization of two gene expression patterns in chick embryos, supporting mechanistic de-risking in early target validation. By providing spatial and temporal resolution of gene co-expression, it enhances predictive confidence in pathway analysis during discovery biology. The approach is particularly relevant for neurodevelopmental and cardiovascular target interrogation where embryonic models inform translational relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing co-expression patterns of signaling molecules and transcription factors in developing tissues.
- Operational Value: Enables functional target validation through spatial mapping of gene activity in neural tube, somite, and heart primordia.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic relationships between genes involved in developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline expression profiles.
- Quantitative Output: Generates spatially resolved, colorimetric readouts enabling comparison of gene expression across experimental conditions.
- Reproducibility: Standardized fixation and hybridization steps support assay standardization across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects embryonic gene expression to postnatal pathophysiology in neurodevelopmental and cardiac disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by validating target expression in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by confirming target engagement in developing tissues prior to mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, supporting hypothesis testing and pathway clarification before lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables mechanistic de-risking by visualizing gene co-expression in developing embryos, clarifying functional relationships between targets.
- Screening: Generates spatially resolved expression data that can inform assay design for compound screening in relevant tissues.
- Analytics: Produces dual-colorimetric readouts allowing quantitative comparison of gene expression patterns under different conditions.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by confirming expression of developmental markers in tissues relevant to human disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating multiple gene targets across developmental timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by revealing spatial relationships between co-expressed genes in developing tissues.
- Operational Value: Standardized protocol ensures reproducibility across laboratories and experimental batches.
- Strategic Value: Improves target selection confidence, reducing late-stage failure due to incorrect mechanistic assumptions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated expression in disease-relevant embryonic systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological dissection and molecular hybridization techniques.
- Dependent on access to dissection microscopes, hybridization ovens, and colorimetric detection systems.
- Necessitates standardization of probe synthesis and antibody titration across users.
- Adaptation to alternative model systems may require optimization of fixation and permeabilization steps.
- Practical limitations include embryo availability, stage-specific permeability, and signal multiplexing constraints beyond two colors.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:49
Introduction
1:16
Fixing and Dehydrating the Embryos
3:28
Prehybridzation
5:15
Hybridizing Embryos with DIG- and FITC- Coupled Probes
6:41
DIG Antibody Incubation and Color Reaction
9:40
FITC Antibody Incubation and Color Reaction
11:52
Fixation and Processing
13:34
Results
15:08
Conclusion
