Reaggregate胸腺文化
2008年8月28日
在这个视频的准备2 dGuo治疗reaggregate胸腺文化是证明。
大家好，我是 Andrea White，来自伯明翰大学 MRC 免疫调节中心的 Graham Anderson 和 Eric Jenkinson 实验室。今天，我提出了一种提取再聚集胸腺器官培养物的方案，该方案可用于研究 T 细胞分化过程中发生的复杂细胞相互作用。在该程序开始之前，分离并处理胚胎胸腺叶以去除所有淋巴细胞。
这可以在单独的视频中看到。然后将外来样片分解以产生基质细胞制备物。最后，细胞聚集以形成重新聚集的 fmic 器官培养物。
让我们开始吧。培养 5 到 7 天后，LO 应准备好解聚以进行 SHAL 细胞制备将 0.8 微米过滤器浸入含有 RPMI 1640 和 10%FCS 的培养皿中 使用镊子轻轻推开任何不会漂浮的纤维斜面。每只宠物使用 1 mil 将裂片转移到 1.5 mil 的 eend 孤儿管中。
我们建议每个 eend Orph 管不超过 50 个裂片。让转子在单位重力下沉降到管底并去除培养基。用 1 mil PBS 清洗波瓣，然后让波瓣再次沉到底部。
重复此作，总共进行 3 次 PBS 洗涤，去除最后一次 PBS 洗涤，并在溶液中加入 600 微升 0.25% 的 A 循环。将 Einor 管放入 37 度培养箱中 25 分钟。用 1 密耳的蓝色尖端在支架上轻轻摩擦裂片 10 秒钟，然后在 20 分钟后放回培养箱中，上下吹打裂片以完全解聚它们。
大约需要 30 秒 要获得单细胞悬液，加入 400 微升冰冷的 RPMI 1640 加 10%FCS 以中和胰蛋白酶 imp 以 1000 RPM 离心沉淀细胞，在 4 摄氏度下 10 分钟，去除 sup natant 并将沉淀重悬于 1 mil 中。如果需要，RPMI 1640 加 10%FCS。计数细胞。
通常，我们预计每个二恶嗪叶大约有 50， 000 个细胞，从 E 15 纤维开始。现在，我们准备在 1.5 mil 的孤儿管中形成聚集体 fmic Corgan 培养物。混合的、新鲜制备的细基质细胞。
与预选的 CD 一起，4 个阳性 CD，8 个阳性纤维细胞。我们建议基质细胞与纤维细胞的比例约为 1：1。您将使用的细胞数量将取决于可用细胞的数量和要进行的实验。
我们建议总共至少有 10 万个细胞，不超过 150 万个细胞。您希望 V 聚集体足够大以便于重现，但又不能太大，以至于中心通过以 1000 RPM 离心 10 分钟来杀死沉淀细胞。在 4 摄氏度下，小心组装器官培养过滤器。
用每只宠物 P 200 去除舞台上的所有 SUP natin。涡旋池沉淀 10 秒以形成浆液。体积应在 1 到 2 微升口左右。
将浆液抚摸成细拉的宠物，保持细胞悬浮液在宠物的尖端。在我们的解剖显微镜下，小心地将细胞浆液口中 PET 到 0.8 微米过滤器的中心。理想情况下，细胞应以直立液滴的形式放置在直径为 1 到 2 毫米的圆圈中。
如果浆液开始扩散，请让浆液中的液体通过 pos 排出，然后再沉积剩余的细胞。将培养皿放入塑料夹心盒中并密封。至于胸腺器官培养物，并将一个盒子放入培养箱中，我们在培养后 18 小时内将培养物形式聚集成完整的结构。
培养 4 到 5 天后，它们将产生 CD 4 阳性 8 阴性和 CD 4 阴性 8 阳性成熟细胞亚群。从 50 个二恶嗪处理的叶开始，应提供足够的基质细胞来制备 3 到 5 个重新聚集的培养物。这些培养物通常表现为连贯的细胞堆，可以使用镊子将其从过滤器上推出，而不会破坏它们。
我们刚刚描述了研究 F 上皮细胞阳性选择的方法。该方法也可用于研究树突状细胞介导的负选择。最后，通过使用 TCR 转基因 FIBROCYTES 或 MHC 1 类缺陷或 MHC 2 类缺陷基质细胞。
该系统允许单独研究 CD 4 阳性或 CD 8 阳性 T 细胞选择。感谢您的收看。
概述
本视频演示了用2-dGuo处理的重聚胸腺培养的准备。这些培养对于研究T细胞分化和细胞间相互作用至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 胸腺器官培养
背景
- 胸腺器官培养用于研究T细胞发育。
- 重聚培养允许检查细胞间相互作用。
- 2-dGuo处理用于准备胸腺叶。
- 理解T细胞分化对免疫学研究至关重要。
研究目的
- 获得重聚胸腺器官培养。
- 研究T细胞分化过程。
- 在受控环境中探索细胞间相互作用。
使用的方法
- 胚胎胸腺叶的分离和处理。
- 解离以生产基质细胞制剂。
- 细胞聚集以形成重聚培养。
- 培养物发育的孵化和观察。
主要结果
- 重聚培养在18小时内形成完整结构。
- 产生CD4阳性和CD8阳性T细胞亚群。
- 该方法允许研究正向和负向选择。
- 利用TCR转基因纤维细胞进行进一步研究。
结论
- 该协议有效地展示了T细胞分化。
- 重聚培养为免疫学研究提供了一个有价值的工具。
- 进一步的研究可以利用这种方法进行各种T细胞选择研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reaggregate thymus cultures enable precise dissection of stromal-hematopoietic interactions critical for T-cell lineage commitment and selection. This three-dimensional in vitro system supports mechanistic de-risking at the target validation stage by allowing controlled manipulation of cellular composition and microenvironment. The approach enhances predictive confidence for immunology-focused discovery portfolios by modeling key aspects of thymic selection and self/non-self discrimination.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of stromal compartment roles in T-cell development and selection.
- Enables functional validation of candidate targets involved in thymic microenvironment signaling.
- Supports mechanistic de-risking by isolating effects of specific cell types or genetic backgrounds.
- Provides a platform for hypothesis-driven manipulation of thymic selection processes.
Screening & Assay Development
- Generates reproducible three-dimensional cultures for standardized functional assays.
- Allows quantitative assessment of T-cell subset differentiation under defined conditions.
- Supports assay development for evaluating modulators of thymic selection or stromal function.
- Enables scalable preparation of organotypic cultures for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant thymic microenvironments for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of immune-modulating interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanisms of T-cell selection.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo immune development processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling controlled, quantitative studies of thymic selection mechanisms in a physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stromal-hematopoietic interactions and pathway elucidation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organotypic cultures for functional evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of T-cell subset generation and selection outcomes.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant immune development and biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse genetic backgrounds and experimental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes three-dimensional culture preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying functional roles of thymic compartments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling and three-dimensional culture techniques.
- Needs access to cell separation, counting, and organ culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell ratios and culture conditions for reproducibility.
- Adaptable to various genetic models, including transgenic or MHC-deficient backgrounds.
- Limited by the scalability of primary tissue sourcing and manual aggregation steps.
