Name: Reaggregate胸腺文化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 了解利用2-dGuo处理制备再聚集胸腺培养物的方法，用于研究T细胞分化和细胞相互作用。该技术可在18小时内形成完整结构，生成CD4和CD8阳性T细胞亚群，为免疫学研究提供重要工具。

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有关制备再聚集胸腺培养物的更多信息，请访问 <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a>。

作者无任何利益冲突需要披露。

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

重组胸腺培养

Reaggregate Thymus Cultures

淋巴组织内的基质细胞以三维结构排列，形成一种被认为可调控造血细胞迁移与发育的支架。值得注意的是，维持这种三维结构对基质细胞的正常功能至关重要，而二维单层培养通常仅能支持淋巴组织部分功能的实现。在胸腺中，皮质与髓质上皮细胞构成复杂的网络结构，作为调控淋巴样前体细胞招募、增殖、分化和存活的框架，这些前体细胞在胸腺内经历多阶段的T细胞发育过程。明确胸腺中各个基质区室的功能作用，对于理解胸腺如何建立自我/非我识别机制至关重要。本文介绍一种利用胎儿组织可塑性使其重新组装为完整三维结构的技术。 体外，经过酶解离后。将胎儿胸腺小叶解离为异质性细胞混合物，随后分离成单独的细胞组分，再与 体外 将这些目标细胞类型以特定比例重新组合成三维再聚集结构，从而可在明确的细胞条件下研究T细胞发育的特定方面。（本文基于首次发表于《分子生物学方法》2007年，第380卷，第185–196页的研究工作。）

本视频展示了经2-dGuo处理的胸腺再聚集培养物的制备过程。

淋巴组织中的基质细胞被组织成三维结构，这些结构形成一种支架，被认为可调控细胞的迁移和……

您好，我是Andrea White，来自伯明翰大学MRC免疫调节中心Graham Anderson和Eric Jenkinson的实验室。今天我将介绍一种用于建立再聚集胸腺器官培养的实验方案，该方法可用于研究T细胞分化过程中发生的复杂细胞间相互作用。在本实验开始之前，已分离得到胚胎期胸腺叶，并经过处理以清除所有淋巴细胞。这可以在另一个视频中观察到。随后将类器官小叶解离，以获得基质细胞悬液。最后，将细胞重新聚集，形成再聚集的 fmic 器官培养物。开始操作。在培养 5 到 7 天后，LO 即可进行解离以制备单细胞悬液。将 0.8 微米滤膜浸入含有 RPMI 1640 加 10% FCS 的培养皿中，用镊子轻轻推动未自行漂浮的纤维斜面。使用 1 mL 移液器将组织小叶转移至 1.5 mL 离心管中。建议每个离心管中不超过 50 个肺叶。让肺叶在 1× 重力下自然沉降到管底，然后吸除上清液。用 1 mL PBS 清洗肺叶，再次让肺叶沉降到管底。重复此步骤，共进行三次 PBS 洗涤，移除最后一次 PBS 洗涤液后，加入 600 微升含 0.25% 胰蛋白酶的溶液。将离心管置于 37 摄氏度培养箱中孵育 25 分钟。使用移液器配装 1 毫升蓝色吸头，轻柔吹打组织块 10 秒，然后放回培养箱中继续孵育 20 分钟后，用移液器反复吹吸组织块，直至完全解离。获得单细胞悬液约需30秒。加入400 µL预冷的含10% FCS的RPMI 1640培养基以中和胰蛋白酶，于4°C、1000 rpm离心10分钟沉淀细胞，弃上清，用1 mL含10% FCS的RPMI 1640培养基重悬细胞（视需要而定），计数细胞。通常情况下，从一个E15期的纤维性组织开始，我们预期每个二恶嗪叶中约有50,000个细胞。现在，我们已准备好在1.5毫升的微量离心管中形成聚集体fmic类器官培养物，并加入新制备的混合间质细胞。与预选的CD4阳性CD8阳性成纤维细胞共同培养。我们建议基质细胞与成纤维细胞的比例约为1:1。所使用的细胞数量将取决于可获得的细胞数量以及拟进行的实验。我们建议细胞总数至少为十万个，最多不超过一百五十万个。V型聚集体应足够大以保证可重复性，但又不能过大，以免中心部位细胞死亡。在1000转/分钟条件下离心10分钟形成细胞沉淀。在4°C条件下，小心组装器官培养滤膜。用 P200 移液器将所有 a SUP 上清液从反应管中移除。涡旋震荡细胞沉淀 10 秒，形成悬液。体积应约为一到两微升。将细胞悬液轻柔地滴加到精细拉制的移液管尖端，保持细胞悬浮液聚集在移液管尖端。在解剖显微镜下，小心地用口吸法将细胞悬液滴加至直径为0.8微米的滤膜中心。理想情况下，细胞应以直立液滴的形式分布成一个直径为1至2毫米的圆形区域。如果悬液开始扩散，需先让悬液中的液体通过滤膜排出，再将剩余的细胞接种。将培养皿放入塑料密封盒中并封好。对于胸腺器官培养，将盒子置于培养箱中，聚集的培养物在培养18小时后会形成完整的结构。经过四到五天的培养后，它们将产生 CD4+8- 和 CD4-8+ 两种成熟的 T 细胞亚群。以 50 个经二嗪处理的胸腺叶开始，应能获得足够数量的基质细胞，用于制备三至五个再聚集培养物。这些培养物通常呈现为结构完整的细胞团块，可用镊子从滤膜上推下而不会破坏其结构。我们刚刚描述了研究F型上皮细胞介导的阳性选择的方法。该方法也可用于研究树突状细胞介导的阴性选择。最后，通过使用TCR转基因成纤维细胞或MHC I类缺陷型或MHC II类缺陷型基质细胞。该系统可分别对 CD4 阳性或 CD8 阳性 T 细胞的选择进行研究。感谢收看。

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

Reaggregate胸腺文化

本视频展示了胎儿胸腺的解剖与摘除，以及经2-dGuo处理的胸腺体外培养的制备过程。...

2-dGuo处理胸腺器官培养物的制备

本视频展示了一种利用三维胸腺培养系统，从诱导多能干细胞（iPSC）来源的不成熟T细胞生成具有功能性的抗原特异性T细胞的实验方案。将iPSC来源的不成熟T细胞与内源性淋巴细胞耗竭的小鼠胎儿胸腺叶共培养后，T细胞成功成熟，形成CD8αβ+ MHC...

用于生成诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本方案详细介绍了通过一系列酶消化步骤从人胸腺中分离抗原提呈细胞的方法，随后对单细胞悬液进行密度梯度离心，最后通过磁珠分选和/或荧光激活细胞分选（FACS）分离目标细胞群体。...

从人胸腺中分离髓系树突状细胞和上皮细胞

本文介绍了一种高效分离、鉴定和纯化小鼠胸腺上皮细胞（TECs）的方法。该方案可用于研究胸腺在正常T细胞发育、胸腺功能障碍以及T细胞重建中的功能。...

小鼠胸腺上皮细胞的分离、鉴定与纯化

研究髓质胸腺上皮细胞 体外 在很大程度上并不成功，因为现有的二维培养系统无法模拟 体内 该3D培养系统——一种改良的皮肤类器官培养模型——在模拟胸腺上皮细胞（mTEC）的增殖、分化以及异位基因表达的维持方面表现出更优效果。...

支持髓质胸腺上皮细胞增殖、分化及异位基因表达的三维类器官共培养模型

本文描述了通过分析T细胞前体的生成动力学、表型及数量，来表征胸腺定植前体细胞的体内和体外方法。...

利用小鼠胚胎胸腺定植前体细胞的表征 体内 和 体外 检测方法

本视频演示了一种利用密度梯度法富集胸腺上皮细胞（TECs）并进行FACS分离的实验方案。同时展示了使用EAK16-II/EAKIIH6多肽促进TEC细胞聚集体形成的步骤。EAK16-II/EAKIIH6水凝胶的微环境可提供维持TEC存活与功能所必需的三维结构。...

促进FACS纯化的胸腺上皮细胞在EAK16-II/EAKIIH6自组装水凝胶中形成三维聚集体

我们描述了胸腺切片的制备方法，该方法结合流式细胞术可用于模拟发育中T细胞的阳性选择和阴性选择。胸腺切片还可适用于 原位...

胸腺类器官切片培养物的制备与应用

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本方案描述了从小鼠胸腺中分离双阴性胸腺细胞，随后进行逆转录病毒转导，并在表达Delta样配体4的骨髓基质细胞系共培养系统（OP9-DL4）上进行共培养，以进一步开展功能分析。...

在表达Delta样4的基质细胞上共培养和转导小鼠胸腺细胞以研究T细胞白血病中的癌基因

在三维纤维蛋白水凝胶中形成功能性人胸腺类器官

了解利用2-dGuo处理制备再聚集胸腺培养物的方法，用于研究T细胞分化和细胞相互作用。该技术可在18小时内形成完整结构，生成CD4和CD8阳性T细胞亚群，为免疫学研究提供重要工具。

重组胸腺培养

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