Name: 2 dGuo治疗胸腺器官培养的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学习使用2-dGuo处理胎儿胸腺器官培养的技术，通过离体培养研究T细胞发育和淋巴细胞的动态变化。该方法有助于深入理解免疫学中的细胞相互作用机制。

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有关胸腺器官离体培养制备的更多信息，请访问 <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a>。

作者无任何利益冲突需要披露。

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

2-dguo处理胸腺器官培养物的制备

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

在胸腺中，发育中的T细胞前体与包括皮质和髓质上皮细胞在内的基质细胞之间的相互作用，已被证实对形成功能健全的T细胞库具有关键作用。然而，胸腺内T细胞发育过程的复杂性 体内 可能会限制对单个细胞组分和特定发育阶段的分析。 体外 培养系统为研究多种复杂的细胞过程提供了便捷的途径。胸腺器官培养系统是一种广泛应用的方法，可用于在明确条件下研究T细胞的胸腺内发育过程 体外在此，我们描述了一种系统，该系统通过在2-脱氧鸟苷（2-deoxyguanosine）中预先进行器官培养，可去除小鼠胚胎胸腺小叶中的内源性造血成分，该化合物对造血细胞具有选择性毒性。该技术不仅为研究胸腺微环境在T细胞发育与选择中的作用提供了易于获取的胸腺基质细胞来源，也为进一步的实验方法奠定了基础，包括无淋巴细胞胸腺小叶的重建 体外 含有明确的造血成分，将无淋巴细胞的胸腺移植到受体小鼠体内，以及重建胸腺类器官培养物的形成。（本文基于首次发表于《Methods in Molecular Biology》2007年第380卷第185–196页的研究工作。）

本视频展示了胎儿胸腺的解剖与摘除，以及经2-dGuo处理的胸腺体外培养的制备过程。

2-dGuo处理胸腺器官培养物的制备

在胸腺中，发育中的T细胞前体与包括皮质和髓质上皮细胞在内的基质细胞之间的相互作用已被证实发挥着重要作用……

大家好，我是来自伯明翰大学MRC免疫调节中心Graham Anderson和Eric Jenkinson课题组的Will Jenkinson。今天我将向大家演示一种建立胎儿胸腺器官培养的方法。此外，我还将展示如何用两种二恶嗪处理这些器官培养物。这种物质在器官培养中对淋巴样细胞具有选择性毒性。该技术在实验室中有多种应用，其中一种应用是制备再聚集的器官培养物。其他应用包括研究细胞发育的不同阶段。通过使用胎鼠胸腺器官培养，我们能够添加抑制或刺激不同信号通路的试剂，从而研究特定分子在此过程中的作用。现在我们开始。制备胸腺器官培养的第一步是从一到两只怀孕母鼠中获取第14或第15天的小鼠胚胎。首先，用70%乙醇喷洒已处死的小鼠。然后用镊子提起毛发，用剪刀从膀胱处开始沿子宫的两个侧角向上在腹部区域做V形切口。取出子宫角并将其放入无菌的10厘米培养皿中。沿子宫壁纵向剪开，取出仍处于羊膜囊中的胚胎。使用两把精细镊子，在含有10 mL PBS的培养皿中清洗胚胎。小心撕开羊膜囊，将胚胎从羊膜囊和胎盘中分离出来。接下来，将胚胎转移至一个新的培养皿中，培养皿内含有10毫升PBS与RPMI 1640培养基按1:1比例混合的溶液，并添加10%胎牛血清（FCS）。在体视显微镜下操作，保持胚胎完全浸没于培养基中，使用镊子切除胚胎头部。将闭合的镊子尖端插入胸腔，然后打开镊子，以暴露胸腔前部的内部结构。轻轻抓住心脏下方，完整取出胸腔内的支气管树、心脏、肺、气管和胸腺，放入一个含有5毫升RPMI 1640培养基（含10% FCS）的35毫米培养皿中，用于第14至15天的胚胎。原始胸腺叶位于心脏上方，紧邻躯干两侧。使用精细镊子分离单个胸腺叶，并在将其转移至器官培养前，去除多余的结缔组织及附着的血液。现在我们已准备好进行器官培养。为制备淋巴组织脱毒液，取一管浓度为九毫摩尔的二氧化嗪储备液，向直径90毫米的细菌培养级塑料培养皿中加入600微升。加入4 mL预热的DMEM培养基，轻轻晃动培养皿，使培养基覆盖整个表面。显然，若要培养淋巴细胞以研究T细胞发育，则需使用镊子去除二恶嗪。将两片预先剪成1平方厘米大小的无菌艺术包裹海绵放入培养皿中。让培养基浸泡海绵约30秒，然后翻转海绵以润湿两面。再次使用镊子确保培养皿中的培养基能够接触到组织。将预先灭菌的孔径为0.8微米的滤膜放置在每块海绵表面。滤膜应光滑面朝上放置于海绵支架上。为了将胸腺组织块转移至器官培养滤膜上，我们通常使用毛细玻璃移液管制作玻璃移液管尖。将玻璃管在本生灯火焰上加热，当玻璃变软时，将玻璃管从火焰中移开，并从两端同时拉伸，使拉伸后的长度不超过10厘米，随后让玻璃自然冷却。然后从两端拉动以折断玻璃。这样可得到两根锥形玻璃管。每根的细端部分长约5厘米，尖端直径约为0.5毫米。安装移液装置时，将一个塑料移液管吸头作为吹嘴插入另一端，并将一根玻璃移液管的钝端插入导管中。用嘴吸法小心吸取单个胸腺叶，并将其放置在孔径为0.8微米的滤膜表面。在器官培养中，建议每个滤膜上放置5至6个胸腺叶，每皿共放置10至12个胸腺叶。这为器官培养提供了充足的空间，并允许两种二恶嗪完全清除所有内源性淋巴细胞。培养体系建立后，将一个10厘米培养皿的皿盖作为平台，放入双蒸水中，使平台略高于水面，组装成一个三明治盒盖。将最多三个培养皿放入盒内，并用胶带将盖子密封固定。盖子应在对角的两个角上各钻一个5毫米的通气孔。将盒子放入37摄氏度、含10%CO2的培养箱中培养5至7天，之后我们对这些培养物进行解聚，再重新聚集成团，以在可控的三维环境中研究基质性胸腺位点的相互作用。经过一段时间的培养（通常为5至7天）后，通过将滤膜浸入培养基中，并用镊子轻轻推下叶状结构来收获F组织。你可以观察到，与未经二噁嗪处理的淋巴叶相比，淋巴样F组织通常更小且呈囊状。我刚刚向您演示了建立胎儿胸腺器官培养的技术。在本方案中，我们向您展示了如何用二恶嗪处理胎儿胸腺器官培养物，通常在培养胸腺组织五到七天后，可耗竭其中所有的淋巴样细胞。我们利用这些器官培养物来制备再聚集的器官培养物。然而，这并不是唯一的技术。我们还使用未经二恶嗪处理的胎鼠胸腺器官培养物，将其移植到小鼠肾包膜下。此外，我们采用淋巴样胎鼠胸腺器官培养系统，在体外可控条件下研究T细胞发育，从而避免体内可能产生的任何继发性影响。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

2 dGuo治疗胸腺器官培养的制备

本视频展示了经2-dGuo处理的胸腺再聚集培养物的制备过程。...

重组胸腺培养

我们开发了用于胸腺活体成像采集的新型实验工具和方案。该技术将有助于识别胸腺内发生T细胞发育的“微环境”。...

利用双光子显微镜对小鼠胸腺进行活体成像

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用于生成诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

本方案详细介绍了通过一系列酶消化步骤从人胸腺中分离抗原提呈细胞的方法，随后对单细胞悬液进行密度梯度离心，最后通过磁珠分选和/或荧光激活细胞分选（FACS）分离目标细胞群体。...

从人胸腺中分离髓系树突状细胞和上皮细胞

本文介绍了一种高效分离、鉴定和纯化小鼠胸腺上皮细胞（TECs）的方法。该方案可用于研究胸腺在正常T细胞发育、胸腺功能障碍以及T细胞重建中的功能。...

小鼠胸腺上皮细胞的分离、鉴定与纯化

研究髓质胸腺上皮细胞 体外 在很大程度上并不成功，因为现有的二维培养系统无法模拟 体内 该3D培养系统——一种改良的皮肤类器官培养模型——在模拟胸腺上皮细胞（mTEC）的增殖、分化以及异位基因表达的维持方面表现出更优效果。...

支持髓质胸腺上皮细胞增殖、分化及异位基因表达的三维类器官共培养模型

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胸腺类器官切片培养物的制备与应用

本文介绍了一种利用三维（3D）胸腺培养系统生成肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的胸腺移行细胞（iTE）的新方法。iTE...

一种用于产生小鼠诱导性多能干细胞来源的肿瘤抗原特异性胸腺移行细胞的三维胸腺培养系统

我们提供一种简单高效的方法，将经2’-脱氧鸟苷处理的E18.5天胸腺移植至裸鼠的肾包膜下。该方法有助于研究胸腺上皮细胞的功能以及T细胞的成熟过程。...

裸鼠肾包膜下移植经2'-脱氧鸟苷处理的小鼠胚胎胸腺

在三维纤维蛋白水凝胶中形成功能性人胸腺类器官

学习使用2-dGuo处理胎儿胸腺器官培养的技术，通过离体培养研究T细胞发育和淋巴细胞的动态变化。该方法有助于深入理解免疫学中的细胞相互作用机制。

2-dGuo处理胸腺器官培养物的制备

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