Name: 围产期缺血缺氧缺血性脑病模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学习围产期缺氧缺血性脑病模型建立方法，通过左颈总动脉结扎和缺氧处理诱导大鼠幼崽脑损伤，使用TTC染色评估梗死区域，为新生儿HIE机制研究与治疗策略开发提供可靠实验工具。

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由美国心脏协会和美国出生缺陷基金会资助。

本方案已获得斯坦福大学机构动物护理和使用委员会的批准，并遵守美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南。
新生大鼠缺氧缺血性脑病模型
<ol>
<li>出生后第7天（PND 7）的Sprague-Dawley大鼠幼崽（Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA）使用异氟烷（Aerrane, Baxter, Deerfield, IL；诱导浓度3-4%，维持浓度1-2%）进行完全麻醉。</li>
<li>在颈部做一小切口（Extra Thin Iris Scissors #14088-10, Fine Science Tools Inc, Foster City, CA），以暴露左侧颈总动脉（CCA）。</li>
<li>使用5-0丝线（5-0 silk, Ethicon, Somer, NJ）结扎颈总动脉。</li>
<li>用氰基丙烯酸酯粘合剂（Elmers Products Inc, Columbus, OH）闭合切口，覆盖胶带后停止麻醉。将幼崽放回母鼠身边，恢复1-2小时。</li>
<li>随后将幼崽置于一个含有8%氧气和92%氮气的低氧舱中，在37°C条件下持续100分钟。8%氧气/92%氮气混合气体（Airgas, Sacramento, CA）通过导管流入配备塑料盖的小鼠笼中。该盖子与笼子紧密贴合，上有两个直径为2 cm的孔，其中一个用于连接8%氧气气源管，另一个用于排出气体。将低氧舱置于水浴中，使用前预热，并确保内部温度计显示为37°C后开始低氧处理。</li>
<li>低氧处理100分钟后，将幼崽再次放回母鼠身边进行恢复。</li>
<li>低氧处理结束后24小时，通过深度异氟烷麻醉处死幼崽。用冷生理盐水灌注脑组织，随后用冷的含1% TTC的磷酸盐缓冲液（pH 7.4）（Sigma Chemical Co, St Louis, MO）灌注。TTC需避光保存。</li>
<li>取出脑组织并在冰上冷却1-2分钟，从视交叉和漏斗部水平开始（相当于成年小鼠脑的前囟1.8 ~ 2.0 mm水平），向后每隔3 mm切取4个冠状切片（水平1-4）。</li>
<li>将脑切片浸入TTC溶液中，在37°C孵育8分钟，随后在4%多聚甲醛/PBS中固定过夜。由于TTC对光敏感，此过程中应避免光照。</li>
<li>对TTC染色的切片进行扫描并数字化。使用Image J软件（NIH, Bethesda, MD）测量每个水平的梗死面积（未染色区域）、同侧半脑面积和对侧半脑面积。每片的梗死面积百分比计算公式为：（梗死面积 / 同侧半脑面积），即A1、A2、A3和A4。梗死体积百分比计算公式为：(A1 + A2 + A3 + A4) × 3 mm。皮层或纹状体损伤区域也可采用类似方法分别定量。</li>
</ol>
代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/old/955_2008_9_2_2/955_Fig-01.png" alt="小鼠脑损伤进展示意图；脑组织损伤程度1至4级的研究。" width="660" height="190" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 图1. 经TTC染色的代表性HIE冠状面切片1-4级。
TTC 染色的冠状切面显示梗死区域（呈白色）。

<ol><li>Rice, J. E. 3rd, Vannucci, R. C., Brierley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+immaturity+on+hypoxic-ischemic+brain+damage+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+neurology%22%5BJournal%5D)">The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat.</a> Annals of neurology. 9 (2), 131-141 (1981).</li>
<li>Vannucci, R. C., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinatal+Hypoxic-Ischemic+Brain+Damage%3A+Evolution+of+an+Animal+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Perinatal Hypoxic-Ischemic Brain Damage: Evolution of an Animal Model.</a> Dev Neurosci. 27 (2-4), 81-86 (2005).</li>
<li>Bona, E., Hagberg, H., Loberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+moderate+hypothermia+after+neonatal+hypoxia-ischemia%3A+short-+and+long-term+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Protective effects of moderate hypothermia after neonatal hypoxia-ischemia: short- and long-term outcome.</a> Pediatric research. 43 (6), 738-738 (1998).</li>
<li>Trescher, W. H., Ishiwa, S., Johnston, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hypothermia+and+hyperthermia+on+attentional+and+spatial+learning+deficits+following+neonatal+hypoxia-ischemic+insult+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Effects of hypothermia and hyperthermia on attentional and spatial learning deficits following neonatal hypoxia-ischemic insult in rats.</a> Behavioural brain research. 151 (1-2), 209-209 (2004).</li>
<li>Mishima, K., Ikeda, T., Yoshikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+post-hypoxic-ischemic+hypothermia+markedly+delays+neonatal+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+development%22%5BJournal%5D)">Brief post-hypoxic-ischemic hypothermia markedly delays neonatal brain injury.</a> Brain development. 19 (5), 326-326 (1997).</li>
<li>Young, R. S., Olenginski, T. P., Yagel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+graded+hypothermia+on+hypoxic-ischemic+brain+damage%3A+a+neuropathologic+study+in+the+neonatal+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">The effect of graded hypothermia on hypoxic-ischemic brain damage: a neuropathologic study in the neonatal rat.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 14 (6), 929-929 (1983).</li>
<li>Bederson, J. B., Pitts, L. H., Germano, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+2%2C3%2C5-triphenyltetrazolium+chloride+as+a+stain+for+detection+and+quantification+of+experimental+cerebral+infarction+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 17 (6), 1304-1304 (1986).</li>
<li>Cai, J., Kang, Z., Liu, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+therapy+reduces+apoptosis+in+neonatal+hypoxia-ischemia+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Hydrogen therapy reduces apoptosis in neonatal hypoxia-ischemia rat model.</a> Neuroscience letters. 441 (2), 167-167 (2008).</li>
<li>Grow, J., Barks, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+hypoxic-ischemic+cerebral+injury+in+the+term+infant%3A+current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+perinatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of hypoxic-ischemic cerebral injury in the term infant: current concepts.</a> Clinics in perinatology. 29 (4), 585-585 (2002).</li>
<li>Aden, U., Halldner, L., Lagercrantz , H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggravated+brain+damage+after+hypoxic+ischemia+in+immature+adenosine+A2A+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Aggravated brain damage after hypoxic ischemia in immature adenosine A2A knockout mice.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 34 (3), 739-739 (2003).</li>
</ol>

啮齿类动物出生后缺氧缺血性脑病（HIE）模型是一种成熟的模型，可重现新生儿围产期发生的脑缺氧情况。大量组织学和免疫细胞化学表征研究表明，出生7天的啮齿类动物大脑发育成熟度与人类胎儿第三孕期相当7。该啮齿类HIE模型在揭示围产期缺氧所致脑损伤机制方面具有重要价值2，一些干预措施（如低温疗法）已在该模型中得到验证3。该模型最初在大鼠中建立，近年来已成功应用于小鼠8。
有一些特定的技术细节需要说明：
<ol>
<li>结扎颈总动脉（CCA）前，务必清除可能缠绕CCA的结缔组织和迷走神经。成功结扎后，结扎部位上方的血管颜色应变为白色。也可采用双重结扎法，即在两个结扎点之间剪断血管。将幼鼠放回母鼠身边之前，应用标签胶带覆盖结扎侧切口。</li>
<li>每只幼鼠的麻醉时间最长不应超过10分钟，以确保CCA结扎操作顺利并获得理想的实验结果。</li>
<li>CCA结扎后的恢复期应为90–120分钟。若时间过短，幼鼠存活率降低；若时间过长，则梗死范围变异性增大，且倾向于形成较小的梗死灶。</li...

<table><tbody><tr><td>斯普拉格-道利大鼠幼崽</td><td>动物</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>手术</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% 氧气 / 92% 氮气</td><td>手术</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-三苯基氯化四氮唑</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) pH 7.4</td><td>试剂</td><td>GIBCO，由 Life Technologies 生产</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

新生儿缺血性缺氧性脑病的围产期缺血模型

The Hypoxic Ischemic Encephalopathy Model of Perinatal Ischemia

缺氧缺血性脑病（HIE）是围产期窒息所致的后果。25%的HIE新生儿会发展为严重的永久性神经心理后遗症，包括智力障碍、脑瘫和癫痫。HIE的结局极为严重且不可逆，因此迫切需要识别并开发有效的治疗策略，以减轻HIE新生儿的脑损伤。为此，研究人员建立了新生大鼠的缺氧缺血性脑损伤模型，以模拟人类这一病理状态。该HIE模型最早由Vannucci等人1验证，并已被广泛用于研究围产期缺氧-缺血所致脑损伤的机制2，以及评估潜在的治疗干预手段3,4。HIE模型分为两个步骤：首先结扎左侧颈总动脉，随后将动物暴露于低氧环境中。由于 Willis 环提供的侧支循环，结扎侧半球的脑血流量（CBF）在常氧状态下不会显著下降；但在低氧条件下，同侧半球的CBF显著减少，从而导致单侧缺血性脑损伤。使用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色以标记和识别缺血脑组织，最初是为成年啮齿类动物脑缺血模型开发的5，现常用于评估缺血事件后72小时内早期脑梗死范围6。在本视频中，我们演示了新生大鼠脑缺氧缺血性损伤模型的建立，以及通过TTC染色评估脑梗死面积的方法。

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型是研究人类新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）的一种成熟模型。本文描述了新生大鼠幼崽中HIE模型的建立方法。

缺氧缺血性脑病（HIE）是出生时发生全身性窒息的后果。25% 的 HIE 新生儿会发展为重度……

为了诱导这种新生儿缺氧性脑病缺血模型，在出生后第七天，Sprague Dawley 大鼠幼崽接受显微外科手术并进行左侧颈总动脉结扎。经过一到两个小时的恢复期后，将幼崽置于37摄氏度的低氧环境中，持续100分钟。随后将幼崽放回母鼠身边，直至实施安乐死。经过两次全身灌注步骤后，取出脑组织并切成3毫米厚的脑片。脑片随后用1% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）溶液染色，以显示梗死区域。大家好，我是来自斯坦福大学医学院神经病学与神经科学系Andre实验室的Hi tango。今天我们将向您展示一种新生小鼠缺氧缺血性脑损伤模型的制备方法。在我们的实验室中，该方法用于研究新生脑缺氧缺血性脑病的发病机制，最终目标是开发新的治疗策略。那么我们开始吧。首先，对一只出生后第七天的Sprague-Dawley幼鼠进行完全麻醉。使用异氟烷时，诱导浓度为4%，维持浓度为1%至2%。数分钟后，进行足趾夹捏测试以确认幼鼠已麻醉。然后使用棉签蘸取10%聚维酮碘对幼鼠颈部进行消毒，随后用70%异丙醇擦拭。接下来，使用Fine Science Tools公司生产的无菌超薄虹膜剪，在中线左侧约五毫米处做一小切口，通过钝性分离暴露左侧颈总动脉（CCA）。务必去除可能缠绕颈总动脉（CCA）的结缔组织和迷走神经。然后使用Ethicon生产的5-0丝线进行结扎颈总动脉（CCA）。结扎后，结扎部位上方的血管颜色应立即变为白色。结扎完成后，使用氰基丙烯酸酯胶水关闭切口，并用胶带覆盖。随后停止麻醉，确保幼鼠恢复意识。将幼崽放入带有温热垫的恢复盒中。根据需要对其他幼崽重复该操作。在将幼崽送回母体之前，至少观察五分钟。在实验前让幼鼠恢复1至2小时。组装一个含有8%氧气、以92%氮气平衡的缺氧室。具体操作为：取一个带有塑料盖的小鼠笼，塑料盖上设有两个直径为2厘米的孔。一个孔连接混合气体罐的管道，混合气体罐中含有8%氧气和92%氮气。另一个孔用于气体流出。将腔室置于水浴中，然后将温度计放入腔室内。在缺氧开始前，温度计读数必须达到37摄氏度。待幼鼠恢复后，将其置于37摄氏度的低氧环境中100分钟。低氧处理结束后24小时，将幼鼠返回母鼠身边，随后通过异氟烷深度麻醉处死幼鼠。接着经左心室进行心内灌注，先用冷的生理盐水灌注，再用冷的1% TTC溶液在P-B-S-T-T-C中灌注，注意TTC具有光敏感性，必须避光保存。灌注步骤完成后，将头部置于冰上1至2分钟，然后使用经冰冷却的剃须刀片在四个层面切开脑组织。用刮勺取出脑片，并将脑片浸入TTC溶液中。将切片置于37摄氏度的培养箱中孵育八分钟，以使TTC染色发生。接着，将切片转移至含4%多聚甲醛的PBS溶液中并覆盖切片。由于TTC对光敏感，随后将切片置于4摄氏度环境中，使其在过夜固定期间保持避光。扫描并数字化TTC染色切片，随后进行结果分析。以下是缺氧缺血性脑病的代表性结果，冠状面水平一至四经TTC染色。未染色的白色区域表示梗死区域，使用ImageJ进行判断。对每一层面测量以下参数：梗死面积A和同侧半脑面积B。基于这些测量值，每一切片的梗死面积百分比通过梗死面积除以同侧半脑面积计算得出，即A₁/B₁、A₂/B₂、A₃/B₃和A₄/B₄。然后，脑梗死体积百分比的计算方法为：将 a1、a2、a3 和 a4 的总和乘以 3 毫米，再除以 B1、B2、B3 和 B4 的总和乘以 3 毫米。皮层或SAL损伤区域也可采用类似方法分别进行定量。我们刚刚向您展示了如何建立围产期缺血所致的缺氧缺血性脑病模型。进行此操作时，需注意每次颈总动脉结扎的麻醉时间不得超过10分钟，始终将温度计置于缺氧舱内，并将温度维持在37摄氏度。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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