Name: 整装在鸡的抗体染色方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习整装在鸡胚胎中进行免疫组织化学染色的完整方法，使用HRP偶联二抗和DAB底物显色。该技术可清晰显示抗原表达模式，并支持后续石蜡切片分析。

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由（J. Dodd、T.M Jessell 和 A. Kawakami）开发的单克隆抗体（15.3B9、PAX7）购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库在NICHD的赞助下建立，并由爱荷华大学生物科学系（爱荷华州，爱荷华市）维护。D.P. 获得美国国家药物滥用研究所（National Institute on Drug Abuse）授予的露丝·柯什斯坦奖（Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1）。本工作由Margaret M. Alkek基金会资助给RHF。

一、示意图概述：
本视频展示了鸡胚整体免疫组织化学染色的各个步骤。首先，用PFA固定胚胎 [IHC1]；然后淬灭内源性过氧化物酶活性 [IHC2]；接着将胚胎与一抗孵育 [IHC3]；经过多次洗涤后，再与二抗孵育 [IHC4]；使用DAB显色 [IHC5]，抗体染色呈橙色 [IHC6]。
<img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure%201.png" alt="免疫组织化学流程图；抗体应用、染色、可视化步骤。" width="600" height="573" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1">
第1部分：胚胎固定
<ol>
<li>对鸡胚进行整体免疫组织化学染色时，首先用镊子轻敲蛋壳并移除部分蛋壳以打开鸡蛋。</li>
<li>用镊子去除浓稠的蛋清，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。</li>
<li>使用精细剪刀在胚胎周围剪下一块方形的卵黄囊。用勺子将胚胎从卵黄上取出，放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。</li>
<li>在解剖显微镜下，小心去除胚胎周围的膜和残留卵黄，并将胚胎转移至另一含有新鲜PBS的培养皿中。</li>
<li>用镊子和昆虫针固定胚胎，吸除PBS，加入含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，在室温下固定1小时。</li>
</ol>
第二部分：抗体步骤前胚胎的准备
<ol>
<li>为尽量减少潜在的微生物污染，后续所有步骤均应使用ddH2O。</li>
<li>胚胎固定后，吸除固定液，并作为化学废弃物妥善处理。用PBS填充培养皿。</li>
<li>接着，使用显微解剖刀在胚胎周围切出一个方形切口，以去除胚外膜。用镊子移除昆虫针。</li>
<li>移除针后，使用钝头巴斯德移液管将胚胎转移至含有PBT（PBS pH 7.4，0.5% Triton X）的闪烁瓶中。</li>
<li>用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗3次。</li>
<li>从闪烁瓶中移除PBT，并替换为含有0.3% H2O2的PBTx，以灭活潜在的内源性过氧化物酶。</li>
<li>在旋转摇床上室温孵育2小时。</li>
<li>用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共3次；随后每次30分钟，共3次。</li>
</ol>
第3部分：抗体孵育
<ol>
<li>为用抗体对胚胎进行染色，首先将胚胎在封闭缓冲液或含1% BSA、1% NGS和PBT的溶液中洗涤1小时（我们使用NGS，因为二抗由山羊产生）。在室温下于摇床上孵育1小时。</li>
<li>用封闭缓冲液将一抗按1:1比例稀释，并将胚胎在此溶液中于4°C在摇床上孵育2天。一抗的稀释倍数取决于所选一抗的种类。此处我们使用来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）的抗体，该抗体以培养上清形式提供，我们用封闭缓冲液将其按1:1稀释。</li>
<li>接下来，在PBT中进行3次、每次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行3次、每次1小时的洗涤。</li>
<li>洗涤后，用封闭缓冲液将二抗按1:2500比例稀释（本实验中使用的是辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）），并将胚胎在4°C于摇床上在此溶液中过夜孵育。</li>
<li>在PBT中进行3次、每次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行3次、每次1小时的洗涤。</li>
</ol>
第3部分：显色反应
<ol>
<li>为了显色染色后的胚胎，首先用 Tris 缓冲液（100 mM Tris HCl，pH 7.4）进行两次、每次 20 分钟的洗涤。</li>
<li>同时，在通风橱中将 DAB 底物（3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐）溶解于 Tris 缓冲液中，终浓度为 500 μg/mL；将溶液置于冰上并避光保存。</li>
<li>移除含有胚胎的小瓶中的最后一次 Tris 缓冲液洗涤液，替换为步骤 3.2 中配制的 5 mL DAB 溶液。在避光条件下，于旋转混合仪上孵育 20 分钟。将使用过的 Eppendorf 吸头弃入含有 10% 次氯酸钠溶液的容器中，以对 DAB 进行去污染处理。</li>
<li>同时，在冰上配制 0.3% 的 H2O2 储存液（溶于 dH2O）。</li>
<li>向含有胚胎和 DAB 溶液的小瓶中加入 50 μL H2O2 储存液。保持避光。1–2 分钟后，在显微镜下观察反应进程。</li>
</ol>
第4部分：胚胎样本的摄影与组织学处理
<ol>
<li>当显色反应完成后，将DAB溶液倒入含漂白剂的废液桶中处理，并加入5 ml自来水替代。</li>
<li>用PBS洗涤两次，每次10分钟。</li>
<li>如需进行拍照及石蜡切片，依次使用25%、50%、75%和100%乙醇进行脱水处理，每级乙醇中各浸泡10分钟。</li>
<li>用0.5–1 ml雪松油替代乙醇（此步骤可使胚胎透明化），随后在雪松油中进行拍照处理。</li>
<li>拍照完成后，将胚胎放回样品管中，用100%乙醇替换雪松油，并重复一次乙醇置换步骤。</li>
<li>用含100%乙醇的5%快绿FCF染色液替换乙醇，孵育3分钟（此步骤可使胚胎在组织学观察中清晰可见）；随后用100%乙醇替换快绿FCF染色液，并进行组织学后续处理。</li>
</ol>
代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="胚胎发育阶段，显微镜图像，神经管和体节形成分析。" width="600" height="498" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图2">
在下图所示的示例中，胚胎分别在HH 10期（A）、12期（B）和11期（C）进行解剖；胚胎在正在形成的神经嵴、体节以及神经管中均显示出PAX7的表达（A，B）；在（C）中，脊索使用15.3B9（Not-1）进行标记（抗体由发育研究杂交瘤库提供）。

<ol><li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system%3A+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li>
<li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+HGF%2FSF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen%27s+node+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li>
<li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
</ol>

本视频展示了在小鸡胚胎中进行整体免疫染色的各个步骤。该方案主要用于在小鸡中对新型抗体进行时空特异性表征2,3，以及利用已知抗原标记物来确定损伤后引起的胚胎畸形4。

<table><tbody><tr><td>鸡蛋</td><td></td><td>Charles River Laboratories</td><td>优质受精卵</td><td>已受精，HH4期（16小时）</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 或类似型号</td><td></td></tr><tr><td>Marsh自动孵育箱</td><td>其他</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子（1）</td><td>工具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>直头镊子（2）</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>工具</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>橡胶吸头</td><td>工具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德毛细移液管</td><td>工具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td>在火焰下将边缘烧圆</td></tr><tr><td>显微解剖刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>用于固定后从周围膜结构中切下胚胎</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体固化剂与基础液</td><td>试剂</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>按1份固化剂与9份基础液混合；在37°C下过夜固化</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>试剂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>试剂</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>一抗</td><td>试剂</td><td>发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）</td><td>4G11, 15.3B9, PAX7</td><td>针对这些抗体，研究人员使用了小鼠供体</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>试剂</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-四盐酸联苯胺（diaminobenzidine tetrahydrochloride）</td><td>试剂</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34001</td><td>于-20°C保存；使用前将瓶恢复至室温</td></tr><tr><td>雪松油</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W522503</td><td></td></tr><tr><td>快绿FCF</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>直径0.2 mm的昆虫针</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr></tbody></table>

鸡胚整体免疫染色方法

关键词：鸡胚，整体染色，免疫荧光，抗体染色，发育生物学

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易获取性以及易于操作的特点，使其成为研究发育中的脑、神经管和体节中抗体表达的理想工具。本视频演示了使用HRP标记的二抗进行整体抗体染色的各个步骤：首先，将鸡胚从蛋中解剖出来，并用多聚甲醛固定；其次，灭活内源性过氧化物酶；然后使鸡胚与一抗孵育。经过多次洗涤后，将鸡胚与HRP标记的二抗共同孵育。通过与二氨基联苯胺底物反应显色，揭示过氧化物酶的活性。最后，对鸡胚进行固定并进行拍照和切片处理。与荧光抗体法相比，该方法的优势在于鸡胚可进行石蜡切片，从而能够研究抗原位点的横切面分布。该方法最初由Jane Dodd和Tom Jessell建立。1.

本视频展示了整体免疫组织化学技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化抗原的空间和时间表达模式。该方法最初由 Jane Dodd 和 Tom Jessell 提出。

鸡胚是研究早期胚胎发育的重要工具。其透明性、易操作性和可及性，使其成为……

本视频展示了利用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗对鸡胚进行整体免疫组织化学染色的不同步骤。首先，用多聚甲醛固定胚胎，然后淬灭内源性过氧化物酶活性。随后将胚胎在一抗中孵育。经过数次洗涤后，将胚胎在与HRP偶联的二抗中孵育，使用DAB底物显色，抗体染色呈橙色。该方法相较于荧光抗体的优势在于，胚胎可进行石蜡切片处理，从而能够对横切面上的抗原位点进行研究。您好，我是来自休斯顿德克萨斯农工大学环境与基因组医学中心FIN实验室的Delphine。今天我们将向您展示一种使用HRP偶联抗体对小鼠胚胎进行激素免疫染色的实验方法。在实验室中，我们利用该方法研究经抗癫痫药物处理后胚胎的形态学变化。现在开始操作：对鸡胚进行整体免疫组织化学染色。首先用镊子轻敲蛋壳并移除部分壳片以打开鸡蛋。用镊子除去浓蛋白，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。接下来，使用精细剪刀在卵黄囊上围绕胚胎剪出一个方形切口。用勺子将胚胎从卵黄中取出，并置于含有PBS的培养皿中，在解剖显微镜下操作。小心去除卵黄中的膜结构，然后将胚胎转移至另一含有PBS的新鲜培养皿中。转移胚胎后，用镊子和昆虫针将胚胎固定，并吸除 PBS。用含 4% PFA 的 PBS 替代，室温下固定胚胎 1 小时，以尽量减少潜在的微生物污染。胚胎固定后，所有后续步骤均使用去离子 H2O。吸除固定液，并作为化学废弃物妥善处理。用BS填充培养皿。接下来，使用显微解剖刀在胚胎周围切割出一个方形，以去除多余的胚外膜。用镊子移除昆虫针后，再将针取出。使用钝头巴斯德移液管将胚胎转移至含有PBT的闪烁瓶中。用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗三次。将闪烁瓶中的PBT移除，并替换为含有0.3% H₂O₂的PBTX，以灭活潜在的内源性过氧化物酶。在摇床上室温孵育2小时。先用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗三次；随后再用PBT清洗三次，每次30分钟。为进行抗体染色，首先将胚胎在封闭缓冲液或含1% BSA、1% NGS的溶液中洗涤一小时。我们使用二代测序（NGS），因为二抗由山羊产生。在突变仪上于室温孵育一小时后，将一抗用封闭缓冲液按1:1比例稀释，并将胚胎在该溶液中于4°C孵育两天。在突变仪上进行。一抗的稀释倍数取决于所选的一抗。此处我们使用来自发育研究杂交DOMA库的抗体，该抗体以超上清形式提供。我们用封闭缓冲液将其按1:1比例稀释。接着，在 PBT 中进行三次每次 10 分钟的洗涤，随后再进行三次每次一小时的 PBT 洗涤。洗涤后，将二抗用封闭缓冲液按 1:2,500 的比例稀释。本实验中使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗 US IgG，将胚胎置于该溶液中，在 4 摄氏度下于摇床中孵育过夜。在PBT中进行三次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行三次1小时的洗涤，以显色染色的胚胎。前两次用三羟甲基氨基甲烷缓冲液（100毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，盐酸，pH 7.4）洗涤20分钟。接着，移除含有胚胎的离心管中的最后一次三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤液，并替换为5毫升DAB溶液。在突变仪中避光孵育20分钟。将移液器吸头弃置到含有10%次氯酸钠溶液的桶中。为了使DAB失活，加入16 µL。将 H₂O₂ 储备液加入含有胚胎的 DAB 小瓶中。避光放置。10 分钟后，在显微镜下监测反应，直至显色反应完成。将 DAB 液体倒入含漂白剂的废液桶中处理，并更换为 5 毫升新溶液。自来水。接着，用 PBS 清洗两次，每次 10 分钟，以备拍照和石蜡切片。将染色后的胚胎在乙醇系列中脱水，依次为 25%、50%、75% 和 100%，每步各 10 分钟。脱水后，用 0.5 至 1 毫升的雪松油替换乙醇。这将使胚胎透明化，便于在雪松油中进行拍照。拍照完成后，将胚胎放回小瓶中，并用 100% 乙醇替换雪松油。最后，用含5%快绿FCF的100%乙醇替换乙醇，孵育三分钟。此步骤可使胚胎在组织学观察中可见。随后用100%乙醇替换快绿FCF溶液，并进行组织学处理。以下是三个染色胚胎的示例。这些 11 期胚胎用 15.3 B 九或非标记，其中 a 是在 Jane dod 和 Tom Gessel 实验室开发的 nodal cord 特异性抗体。在DAB中孵育2分钟后，胚胎仍保持透明。在DAB中孵育20分钟后，脊索中出现轻微染色。最终，在DAB中孵育40分钟后，脊索的染色完成。在此示例中，我们展示了PAC7抗体（由Tom Jessel实验室开发）如何识别神经管闭合的早期阶段以及从中脑迁移而出的颅神经嵴细胞。此处胚胎使用了David Wilkinson实验室的Croc 20探针进行标记，随后未使用单一抗体。我们刚刚向您演示了如何对胚胎进行整体免疫组织化学染色。该步骤也可用于此前已进行过整体原位杂交处理的胚胎。在此情况下，原位杂交完成后，将胚胎短暂固定一小时，随后继续进行抗体染色。以上即为全部操作。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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