Name: 整装在鸡的抗体染色方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习整装在鸡胚胎中进行免疫组织化学染色的完整方法，使用HRP偶联二抗和DAB底物显色。该技术可清晰显示抗原表达模式，并支持后续石蜡切片分析。

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由（J. Dodd、T.M Jessell 和 A. Kawakami）开发的单克隆抗体（15.3B9、PAX7）购自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank），该库在NICHD的赞助下建立，并由爱荷华大学生物科学系（爱荷华州，爱荷华市）维护。D.P. 获得美国国家药物滥用研究所（National Institute on Drug Abuse）授予的露丝·柯什斯坦奖（Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1）。本工作由Margaret M. Alkek基金会资助给RHF。

一、示意图概述：
本视频展示了鸡胚整体免疫组织化学染色的各个步骤。首先，用PFA固定胚胎 [IHC1]；然后淬灭内源性过氧化物酶活性 [IHC2]；接着将胚胎与一抗孵育 [IHC3]；经过多次洗涤后，再与二抗孵育 [IHC4]；使用DAB显色 [IHC5]，抗体染色呈橙色 [IHC6]。
<img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_3/figure%201.png" alt="免疫组织化学流程图；抗体应用、染色、可视化步骤。" width="600" height="573" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图1">
第1部分：胚胎固定
<ol>
<li>对鸡胚进行整体免疫组织化学染色时，首先用镊子轻敲蛋壳并移除部分蛋壳以打开鸡蛋。</li>
<li>用镊子去除浓稠的蛋清，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。</li>
<li>使用精细剪刀在胚胎周围剪下一块方形的卵黄囊。用勺子将胚胎从卵黄上取出，放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。</li>
<li>在解剖显微镜下，小心去除胚胎周围的膜和残留卵黄，并将胚胎转移至另一含有新鲜PBS的培养皿中。</li>
<li>用镊子和昆虫针固定胚胎，吸除PBS，加入含4%多聚甲醛（PFA）的PBS溶液，在室温下固定1小时。</li>
</ol>
第二部分：抗体步骤前胚胎的准备
<ol>
<li>为尽量减少潜在的微生物污染，后续所有步骤均应使用ddH2O。</li>
<li>胚胎固定后，吸除固定液，并作为化学废弃物妥善处理。用PBS填充培养皿。</li>
<li>接着，使用显微解剖刀在胚胎周围切出一个方形切口，以去除胚外膜。用镊子移除昆虫针。</li>
<li>移除针后，使用钝头巴斯德移液管将胚胎转移至含有PBT（PBS pH 7.4，0.5% Triton X）的闪烁瓶中。</li>
<li>用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗3次。</li>
<li>从闪烁瓶中移除PBT，并替换为含有0.3% H2O2的PBTx，以灭活潜在的内源性过氧化物酶。</li>
<li>在旋转摇床上室温孵育2小时。</li>
<li>用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共3次；随后每次30分钟，共3次。</li>
</ol>
第3部分：抗体孵育
<ol>
<li>为用抗体对胚胎进行染色，首先将胚胎在封闭缓冲液或含1% BSA、1% NGS和PBT的溶液中洗涤1小时（我们使用NGS，因为二抗由山羊产生）。在室温下于摇床上孵育1小时。</li>
<li>用封闭缓冲液将一抗按1:1比例稀释，并将胚胎在此溶液中于4°C在摇床上孵育2天。一抗的稀释倍数取决于所选一抗的种类。此处我们使用来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）的抗体，该抗体以培养上清形式提供，我们用封闭缓冲液将其按1:1稀释。</li>
<li>接下来，在PBT中进行3次、每次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行3次、每次1小时的洗涤。</li>
<li>洗涤后，用封闭缓冲液将二抗按1:2500比例稀释（本实验中使用的是辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）），并将胚胎在4°C于摇床上在此溶液中过夜孵育。</li>
<li>在PBT中进行3次、每次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行3次、每次1小时的洗涤。</li>
</ol>
第3部分：显色反应
<ol>
<li>为了显色染色后的胚胎，首先用 Tris 缓冲液（100 mM Tris HCl，pH 7.4）进行两次、每次 20 分钟的洗涤。</li>
<li>同时，在通风橱中将 DAB 底物（3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐）溶解于 Tris 缓冲液中，终浓度为 500 μg/mL；将溶液置于冰上并避光保存。</li>
<li>移除含有胚胎的小瓶中的最后一次 Tris 缓冲液洗涤液，替换为步骤 3.2 中配制的 5 mL DAB 溶液。在避光条件下，于旋转混合仪上孵育 20 分钟。将使用过的 Eppendorf 吸头弃入含有 10% 次氯酸钠溶液的容器中，以对 DAB 进行去污染处理。</li>
<li>同时，在冰上配制 0.3% 的 H2O2 储存液（溶于 dH2O）。</li>
<li>向含有胚胎和 DAB 溶液的小瓶中加入 50 μL H2O2 储存液。保持避光。1–2 分钟后，在显微镜下观察反应进程。</li>
</ol>
第4部分：胚胎样本的摄影与组织学处理
<ol>
<li>当显色反应完成后，将DAB溶液倒入含漂白剂的废液桶中处理，并加入5 ml自来水替代。</li>
<li>用PBS洗涤两次，每次10分钟。</li>
<li>如需进行拍照及石蜡切片，依次使用25%、50%、75%和100%乙醇进行脱水处理，每级乙醇中各浸泡10分钟。</li>
<li>用0.5–1 ml雪松油替代乙醇（此步骤可使胚胎透明化），随后在雪松油中进行拍照处理。</li>
<li>拍照完成后，将胚胎放回样品管中，用100%乙醇替换雪松油，并重复一次乙醇置换步骤。</li>
<li>用含100%乙醇的5%快绿FCF染色液替换乙醇，孵育3分钟（此步骤可使胚胎在组织学观察中清晰可见）；随后用100%乙醇替换快绿FCF染色液，并进行组织学后续处理。</li>
</ol>
代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/old/956_2009_1_26_2/figure2.png" alt="胚胎发育阶段，显微镜图像，神经管和体节形成分析。" width="600" height="498" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="图2">
在下图所示的示例中，胚胎分别在HH 10期（A）、12期（B）和11期（C）进行解剖；胚胎在正在形成的神经嵴、体节以及神经管中均显示出PAX7的表达（A，B）；在（C）中，脊索使用15.3B9（Not-1）进行标记（抗体由发育研究杂交瘤库提供）。

<ol><li>Yamada, T., Placzek, M., Tanaka, H., Dodd, J., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+developing+nervous+system%3A+Polarizing+activity+of+the+floor+plate+and+notochord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the developing nervous system: Polarizing activity of the floor plate and notochord.</a> Cell. 64, 635-647 (1991).</li>
<li>Streit, A., Stern, C. D., Thery, C., Ireland, G. W., Aparicio, S., Sharpe, M. J., Gherardi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+HGF%2FSF+in+neural+induction+and+its+expression+in+Hensen%27s+node+during+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A role for HGF/SF in neural induction and its expression in Hensen's node during gastrulation.</a> Development. 121, 813-824 (1995).</li>
<li>Basch, M., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+neural+crest+occurs+during+gastrulation+and+requires+Pax7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specification of neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7.</a> Nature. 441, 218-222 (2006).</li>
<li>Psychoyos, D., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+the+organizer+after+radical+ablation+of+Hensen%27s+node+and+the+anterior+primitive+streak+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo.</a> Development. 122, 3263-3273 (1996).</li>
</ol>

本视频展示了在小鸡胚胎中进行整体免疫染色的各个步骤。该方案主要用于在小鸡中对新型抗体进行时空特异性表征2,3，以及利用已知抗原标记物来确定损伤后引起的胚胎畸形4。

<table><tbody><tr><td>鸡蛋</td><td></td><td>Charles River Laboratories</td><td>优质受精卵</td><td>已受精，HH4期（16小时）</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ9.5 或类似型号</td><td></td></tr><tr><td>Marsh自动孵育箱</td><td>其他</td><td>Lyon</td><td>RX</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子（1）</td><td>工具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72991-4C</td><td></td></tr><tr><td>直头镊子（2）</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>11002-13</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>14161-10</td><td></td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>工具</td><td>Falcon BD</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>橡胶吸头</td><td>工具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70980</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德毛细移液管</td><td>工具</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70950-12</td><td>在火焰下将边缘烧圆</td></tr><tr><td>显微解剖刀</td><td>工具</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td>用于固定后从周围膜结构中切下胚胎</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅弹性体固化剂与基础液</td><td>试剂</td><td>Dow Corning</td><td>0001986475</td><td>按1份固化剂与9份基础液混合；在37°C下过夜固化</td></tr><tr><td>16% PFA</td><td>试剂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>30% H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td>NGS</td><td>试剂</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>一抗</td><td>试剂</td><td>发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）</td><td>4G11, 15.3B9, PAX7</td><td>针对这些抗体，研究人员使用了小鼠供体</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）</td><td>试剂</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-四盐酸联苯胺（diaminobenzidine tetrahydrochloride）</td><td>试剂</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>34001</td><td>于-20°C保存；使用前将瓶恢复至室温</td></tr><tr><td>雪松油</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W522503</td><td></td></tr><tr><td>快绿FCF</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>直径0.2 mm的昆虫针</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr></tbody></table>

鸡胚整体免疫染色方法

关键词：鸡胚，整体染色，免疫荧光，抗体染色，发育生物学

Method for Whole Mount Antibody Staining in Chick

鸡胚是研究早期胚胎发育的宝贵工具。其透明性、易获取性以及易于操作的特点，使其成为研究发育中的脑、神经管和体节中抗体表达的理想工具。本视频演示了使用HRP标记的二抗进行整体抗体染色的各个步骤：首先，将鸡胚从蛋中解剖出来，并用多聚甲醛固定；其次，灭活内源性过氧化物酶；然后使鸡胚与一抗孵育。经过多次洗涤后，将鸡胚与HRP标记的二抗共同孵育。通过与二氨基联苯胺底物反应显色，揭示过氧化物酶的活性。最后，对鸡胚进行固定并进行拍照和切片处理。与荧光抗体法相比，该方法的优势在于鸡胚可进行石蜡切片，从而能够研究抗原位点的横切面分布。该方法最初由Jane Dodd和Tom Jessell建立。1.

本视频展示了整体免疫组织化学技术，该方法可用于在年轻的鸡胚中可视化抗原的空间和时间表达模式。该方法最初由 Jane Dodd 和 Tom Jessell 提出。

鸡胚是研究早期胚胎发育的重要工具。其透明性、易操作性和可及性，使其成为……

本视频展示了利用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗对鸡胚进行整体免疫组织化学染色的不同步骤。首先，用多聚甲醛固定胚胎，然后淬灭内源性过氧化物酶活性。随后将胚胎在一抗中孵育。经过数次洗涤后，将胚胎在与HRP偶联的二抗中孵育，使用DAB底物显色，抗体染色呈橙色。该方法相较于荧光抗体的优势在于，胚胎可进行石蜡切片处理，从而能够对横切面上的抗原位点进行研究。您好，我是来自休斯顿德克萨斯农工大学环境与基因组医学中心FIN实验室的Delphine。今天我们将向您展示一种使用HRP偶联抗体对小鼠胚胎进行激素免疫染色的实验方法。在实验室中，我们利用该方法研究经抗癫痫药物处理后胚胎的形态学变化。现在开始操作：对鸡胚进行整体免疫组织化学染色。首先用镊子轻敲蛋壳并移除部分壳片以打开鸡蛋。用镊子除去浓蛋白，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。接下来，使用精细剪刀在卵黄囊上围绕胚胎剪出一个方形切口。用勺子将胚胎从卵黄中取出，并置于含有PBS的培养皿中，在解剖显微镜下操作。小心去除卵黄中的膜结构，然后将胚胎转移至另一含有PBS的新鲜培养皿中。转移胚胎后，用镊子和昆虫针将胚胎固定，并吸除 PBS。用含 4% PFA 的 PBS 替代，室温下固定胚胎 1 小时，以尽量减少潜在的微生物污染。胚胎固定后，所有后续步骤均使用去离子 H2O。吸除固定液，并作为化学废弃物妥善处理。用BS填充培养皿。接下来，使用显微解剖刀在胚胎周围切割出一个方形，以去除多余的胚外膜。用镊子移除昆虫针后，再将针取出。使用钝头巴斯德移液管将胚胎转移至含有PBT的闪烁瓶中。用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗三次。将闪烁瓶中的PBT移除，并替换为含有0.3% H₂O₂的PBTX，以灭活潜在的内源性过氧化物酶。在摇床上室温孵育2小时。先用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗三次；随后再用PBT清洗三次，每次30分钟。为进行抗体染色，首先将胚胎在封闭缓冲液或含1% BSA、1% NGS的溶液中洗涤一小时。我们使用二代测序（NGS），因为二抗由山羊产生。在突变仪上于室温孵育一小时后，将一抗用封闭缓冲液按1:1比例稀释，并将胚胎在该溶液中于4°C孵育两天。在突变仪上进行。一抗的稀释倍数取决于所选的一抗。此处我们使用来自发育研究杂交DOMA库的抗体，该抗体以超上清形式提供。我们用封闭缓冲液将其按1:1比例稀释。接着，在 PBT 中进行三次每次 10 分钟的洗涤，随后再进行三次每次一小时的 PBT 洗涤。洗涤后，将二抗用封闭缓冲液按 1:2,500 的比例稀释。本实验中使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗 US IgG，将胚胎置于该溶液中，在 4 摄氏度下于摇床中孵育过夜。在PBT中进行三次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行三次1小时的洗涤，以显色染色的胚胎。前两次用三羟甲基氨基甲烷缓冲液（100毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，盐酸，pH 7.

method-for-whole-mount-antibody-staining-in-chick

Research

科研

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Biology

生物学

整装在鸡的抗体染色方法

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