鸡胚整体免疫染色方法 关键词：鸡胚，整体染色，免疫荧光，抗体染色，发育生物学

本视频展示了利用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗对鸡胚进行整体免疫组织化学染色的不同步骤。首先，用多聚甲醛固定胚胎，然后淬灭内源性过氧化物酶活性。

随后将胚胎在一抗中孵育。经过数次洗涤后，将胚胎在与HRP偶联的二抗中孵育，使用DAB底物显色，抗体染色呈橙色。该方法相较于荧光抗体的优势在于，胚胎可进行石蜡切片处理，从而能够对横切面上的抗原位点进行研究。

您好，我是来自休斯顿德克萨斯农工大学环境与基因组医学中心FIN实验室的Delphine。今天我们将向您展示一种使用HRP偶联抗体对小鼠胚胎进行激素免疫染色的实验方法。在实验室中，我们利用该方法研究经抗癫痫药物处理后胚胎的形态学变化。

现在开始操作：对鸡胚进行整体免疫组织化学染色。首先用镊子轻敲蛋壳并移除部分壳片以打开鸡蛋。用镊子除去浓蛋白，并用粗镊子倾斜卵黄囊，使胚胎朝上。

接下来，使用精细剪刀在卵黄囊上围绕胚胎剪出一个方形切口。用勺子将胚胎从卵黄中取出，并置于含有PBS的培养皿中，在解剖显微镜下操作。小心去除卵黄中的膜结构，然后将胚胎转移至另一含有PBS的新鲜培养皿中。

转移胚胎后，用镊子和昆虫针将胚胎固定，并吸除 PBS。用含 4% PFA 的 PBS 替代，室温下固定胚胎 1 小时，以尽量减少潜在的微生物污染。胚胎固定后，所有后续步骤均使用去离子 H2O。吸除固定液，并作为化学废弃物妥善处理。

用BS填充培养皿。接下来，使用显微解剖刀在胚胎周围切割出一个方形，以去除多余的胚外膜。用镊子移除昆虫针后，再将针取出。使用钝头巴斯德移液管将胚胎转移至含有PBT的闪烁瓶中。

用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗三次。将闪烁瓶中的PBT移除，并替换为含有0.3% H₂O₂的PBTX，以灭活潜在的内源性过氧化物酶。在摇床上室温孵育2小时。

先用PBT清洗胚胎，每次10分钟，共清洗三次；随后再用PBT清洗三次，每次30分钟。为进行抗体染色，首先将胚胎在封闭缓冲液或含1% BSA、1% NGS的溶液中洗涤一小时。

我们使用二代测序（NGS），因为二抗由山羊产生。在突变仪上于室温孵育一小时后，将一抗用封闭缓冲液按1:1比例稀释，并将胚胎在该溶液中于4°C孵育两天。在突变仪上进行。

一抗的稀释倍数取决于所选的一抗。此处我们使用来自发育研究杂交DOMA库的抗体，该抗体以超上清形式提供。我们用封闭缓冲液将其按1:1比例稀释。

接着，在 PBT 中进行三次每次 10 分钟的洗涤，随后再进行三次每次一小时的 PBT 洗涤。洗涤后，将二抗用封闭缓冲液按 1:2,500 的比例稀释。本实验中使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗 US IgG，将胚胎置于该溶液中，在 4 摄氏度下于摇床中孵育过夜。

在PBT中进行三次10分钟的洗涤，随后在PBT中进行三次1小时的洗涤，以显色染色的胚胎。前两次用三羟甲基氨基甲烷缓冲液（100毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷，盐酸，pH 7.4）洗涤20分钟。接着，移除含有胚胎的离心管中的最后一次三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗涤液，并替换为5毫升DAB溶液。

在突变仪中避光孵育20分钟。将移液器吸头弃置到含有10%次氯酸钠溶液的桶中。为了使DAB失活，加入16 µL。

将 H₂O₂ 储备液加入含有胚胎的 DAB 小瓶中。避光放置。10 分钟后，在显微镜下监测反应，直至显色反应完成。将 DAB 液体倒入含漂白剂的废液桶中处理，并更换为 5 毫升新溶液。

自来水。接着，用 PBS 清洗两次，每次 10 分钟，以备拍照和石蜡切片。将染色后的胚胎在乙醇系列中脱水，依次为 25%、50%、75% 和 100%，每步各 10 分钟。

脱水后，用 0.5 至 1 毫升的雪松油替换乙醇。这将使胚胎透明化，便于在雪松油中进行拍照。拍照完成后，将胚胎放回小瓶中，并用 100% 乙醇替换雪松油。

最后，用含5%快绿FCF的100%乙醇替换乙醇，孵育三分钟。此步骤可使胚胎在组织学观察中可见。随后用100%乙醇替换快绿FCF溶液，并进行组织学处理。

以下是三个染色胚胎的示例。这些 11 期胚胎用 15.3 B 九或非标记，其中 a 是在 Jane dod 和 Tom Gessel 实验室开发的 nodal cord 特异性抗体。

在DAB中孵育2分钟后，胚胎仍保持透明。在DAB中孵育20分钟后，脊索中出现轻微染色。最终，在DAB中孵育40分钟后，脊索的染色完成。

在此示例中，我们展示了PAC7抗体（由Tom Jessel实验室开发）如何识别神经管闭合的早期阶段以及从中脑迁移而出的颅神经嵴细胞。此处胚胎使用了David Wilkinson实验室的Croc 20探针进行标记，随后未使用单一抗体。我们刚刚向您演示了如何对胚胎进行整体免疫组织化学染色。

该步骤也可用于此前已进行过整体原位杂交处理的胚胎。在此情况下，原位杂交完成后，将胚胎短暂固定一小时，随后继续进行抗体染色。以上即为全部操作。

感谢观看，祝您的实验顺利成功。