Name: 一个串行收集脑脊液从池鼠标麦格纳技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学习从转基因阿尔茨海默病小鼠模型中连续采集脑脊液的精细技术。该方法通过玻璃毛细管穿刺枕骨大池，实现Aβ和tau蛋白水平的纵向监测，为疾病进展研究提供可靠的生物标志物分析手段。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS048447 和 AG017216 资助，项目负责人为 KD。刘莉感谢芬兰库奥皮奥大学（University of Kuopio, Kuopio, Finland）的 Heikki Tanila 博士在原始实验方案开发过程中提供的指导与支持。

拉制玻璃毛细管
<ol>
<li>玻璃毛细管购自 Sutter Instrument Inc（硼硅酸盐玻璃，B100-75-10）。</li>
<li>使用 Sutter P-87 Flaming 微量移液器拉制仪拉制毛细管，加热指数设为 300，压力指数设为 330。</li>
<li>用剪刀修剪玻璃毛细管尖端，使锥形尖端的内径约为 0.5 mm。</li>
</ol>
脑池穿刺脑脊液采集技术
采用先前已发表的方法1，从小脑延髓池（图1）采集脑脊液样本。 <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_2/960_Figure-01.png" alt="脑部解剖图：小脑、小脑延髓池、大脑皮层、脑干标注。" width="432" height="184" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图1"> 图1
1. 通过腹腔注射给予小鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉。在麻醉诱导期间，将小鼠置于37oC的培养箱中。
2. 剃除小鼠颈部皮肤的毛发，然后将其俯卧固定于立体定位仪上，并与加热垫直接接触。将直肠温度探针插入直肠，以便根据体温变化调节加热垫产生的热量。使用头部适配器固定头部。手术区域用10%聚维酮碘棉签擦拭消毒 碘，随后是 70% 乙醇（重复 3 次），并在枕骨下方做一矢状切口。
3. 在解剖显微镜下，用镊子进行钝性分离，将皮下组织和肌肉（m. biventer cervicis 和 m. rectus capitis dorsalis major）分开。使用一对微型牵开器将肌肉牵开。
4. 将小鼠平放，使其头部与身体形成接近135o的角度。
5. 在解剖显微镜下，小脑延髓池的硬脑膜呈现为一个有光泽且透明的倒三角形结构，可通过其观察到延髓、一条主要血管（脊髓后动脉）以及脑脊液腔（图2）。 <img src="/files/ftp_upload/old/960_2008_10_13_3/960_Figure-02.png" alt="手术解剖示意图；解剖操作；组织暴露；教学用途。" width="304" height="307" data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="图2"> 图2
6. 使用无菌棉签将硬脑膜擦干。将毛细管穿过硬脑膜，插入小脑延髓池，位置位于脊髓背动脉外侧（图2）。当感觉到毛细管插入阻力明显变化时，脑脊液便会流入毛细管中。
7. 小心移除毛细管，并通过内径为1 mm的聚乙烯管将其连接至3 ml注射器。将脑脊液注入预先标记的0.5 ml离心管中，立即在干冰上速冻，随后转移至-80°C冰箱中保存。
8. 脑脊液采集后，将肌肉复位，皮肤缝合（4-0，Ethicon，Johnson &amp; Johnson）。皮下注射约1 ml的0.9% NaCl以防止脱水。将小鼠置于培养箱中以维持体温直至其恢复；术后1天和1周时监测小鼠体重。
结果与讨论
我们描述了一种高度可靠的从小鼠中连续采集脑脊液的方案，且无明显血浆污染。
1. 整个操作过程通常每只小鼠需要10分钟（包括麻醉时间）。所获得脑脊液的体积取决于小鼠品系。在我们使用的PS/APP双转基因小鼠2中，平均体积约为5 μl（3至7 μl），而P301L（JNPL3）小鼠3的产量约为10 μl至15 μl。对于连续取样，每次可安全采集的最大体积为7-8 μl，采集间隔为2-3个月。
2. 手术过程中，重要的是将小鼠的头部和身体在立体定位仪上正确放置，以便充分暴露小脑延髓池的硬脑膜。使用毛细管穿刺硬脑膜时应小心避开血管，以防止血浆蛋白污染，这种污染可通过针对ApoB4的免疫印迹法在脑脊液样本中检测到。
3. 每次手术过程中尽量减少组织损伤非常重要，因为组织粘连可能会增加后续取样时出血的风险，从而加大操作难度。
4. 手术期间需要良好维持体温，因为麻醉引起的低体温会迅速显著影响脑内磷酸化tau蛋白的水平5。
5. 我们所使用的 Ab ELISA 方案及抗体在 Refolo 等人的研究中已有详细描述6。将来自 PS/APP 小鼠的 2 μl 脑脊液按 1:50–1:60 稀释后，即可获得满意的结果。对于 tau ELISA，来自 P301L（JNPL3）小鼠的 4–5 μl 脑脊液足以用于总 tau 或在苏氨酸 231 位点 磷酸化的 tau 检测（试剂盒购自 Bio-Source）。
6. 该技术可应用于其他神经疾病的小鼠模型，对于这些模型，少量脑脊液即可满足所需检测的要求。

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+observation+on+CSF+Abeta42+levels+in+young+to+middle-aged+amyloid+precursor+protein%2Fpresenilin-1+doubly+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice.</a> Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).</li>
<li>Holcomb, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+Alzheimer-type+phenotype+in+transgenic+mice+carrying+both+mutant+amyloid+precursor+protein+and+presenilin+1+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes.</a> Nat Med. 4, 97(1998).</li>
<li>Lewis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibrillary+tangles%2C+amyotrophy+and+progressive+motor+disturbance+in+mice+expressing+mutant+%28P301L%29+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein.</a> Nat Genet. 25, 402- (2000).</li>
<li>DeMattos, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plaque-associated+disruption+of+CSF+and+plasma+amyloid-beta+%28Abeta%29+equilibrium+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neurochem. 81, 229(2002).</li>
<li>Planel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+leads+to+tau+hyperphosphorylation+through+inhibition+of+phosphatase+activity+by+hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia.</a> J Neurosci. 27, 3090(2007).</li>
<li>Refolo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cholesterol-lowering+drug+reduces+beta-amyloid+pathology+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Neurobiol Dis. 8, 890(2001).</li>
</ol>

我们描述了一种高度可靠的从小鼠中连续采集脑脊液的方案，且无明显血浆污染。
整个操作过程通常每只小鼠需要10分钟（包括麻醉时间）。所获取脑脊液的体积取决于小鼠品系。在我们使用的PS/APP双转基因小鼠2中，平均体积约为5 μl（3至7 μl），而P301L（JNPL3）小鼠3每次可获得约10 μl至15 μl。对于连续取样，每次可安全采集的最大体积为7–8 μl，采样间隔应为2–3个月。

2. 手术过程中，重要的是将小鼠的头部和身体在立体定位仪上正确放置，以便充分暴露小脑延髓池的硬脑膜。使用毛细管穿刺硬脑膜时应小心避开血管，以防止血浆蛋白污染，这种污染可通过针对ApoB4的免疫印迹法在脑脊液样本中检测到。

3. 每次手术过程中尽量减少组织损伤非常重要，因为组织粘连可能增加后续取样时出血的风险，从而加大操作难度。

4. 手术期间需要良好维持体温，因为麻醉引起的低体温会迅速显著影响脑内磷...

一种在小鼠中通过大池进行脑脊液连续采集的技术

A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse 

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其病理特征为细胞外沉积β-淀粉样肽（Aβ）和神经元内聚集过度磷酸化的tau蛋白。由于脑脊液（CSF）与大脑的细胞外空间直接接触，因此能够反映脑内生化变化对病理过程的响应。AD患者的脑脊液中，Aβ的42个氨基酸形式（Aβ42）水平降低，总tau蛋白和过度磷酸化tau蛋白水平升高，但导致这些变化的机制尚未完全阐明。AD转基因（Tg）小鼠模型为研究疾病进展过程中脑脊液中Aβ或tau水平变化的原因和机制提供了极佳的机会。本文展示了一种改良的大脑池穿刺技术，用于从小鼠中采集脑脊液。这种极为温和的采样技术允许在2-3个月的间隔内对同一只小鼠进行多次脑脊液取样，从而极大程度地减少了不同小鼠间Aβ或tau水平差异带来的干扰，使得检测随时间发生的细微变化成为可能。结合Aβ和tau的ELISA检测，该技术将有助于研究AD小鼠模型中脑脊液Aβ42和tau水平与其脑内代谢之间的关系。在转基因小鼠中开展的研究可为脑脊液Aβ或tau水平作为监测疾病进展的生物标志物的潜力提供重要验证，并可用于评估治疗干预的效果。由于小鼠可在实验后被处死，其脑组织可进行生化或组织学分析，因此能够更深入地评估脑脊液变化背后的机制。这些数据可能对解读人类AD患者脑脊液变化具有重要参考价值。

阿尔茨海默病（AD）的转基因（Tg）小鼠模型为研究疾病进展过程中人脑脊液（CSF）内Aβ或tau蛋白水平变化的机制和原因提供了极佳的机会。本文中，我们展示了一种改良的大脑池穿刺技术，用于对小鼠进行系列脑脊液取样。

阿尔茨海默病（AD）是一种进行性神经退行性疾病，其病理特征为细胞外沉积β-淀粉样蛋白……

该操作首先对小鼠进行麻醉并准备手术区域。随后将小鼠俯卧位固定于立体定位仪上。在枕骨下方做一矢状切口，沿中线钝性分离皮下组织及颈部肌肉。然后将身体的后部放置，使身体与固定的头部形成135度角，用玻璃毛细管穿透枕大孔处的硬脑膜，收集脑脊液。脑脊液采集后，重新对齐肌肉，缝合皮肤，皮下注射约一毫升0.9% NaCl生理盐水以防止脱水，并将小鼠保温直至其恢复。您好，我来自哥伦比亚大学凯伦·达夫博士实验室的刘。今天我将向您展示如何从小鼠的脑池系统中采集脑脊液。通过该技术，我们可以在同一小鼠身上以两到三个月为间隔，连续采集最多三次脑脊液样本。在我们的实验室中，我们利用该技术测定阿尔茨海默病转基因小鼠模型在不同年龄阶段的脑脊液Aβ或tau蛋白水平，并将这些数值与脑组织中的相应指标进行关联分析。最后，我们关注的是脑脊液中 CSFA β 或 τ 水平作为疾病进展以及小鼠治疗试验中潜在生物标志物的价值。现在我们开始。进行此操作需要使用微量移液器拉制毛细管。此处使用的毛细管为 Sutter Instruments 公司的 BOA 硅酸盐玻璃 B 175 10，使用 Sutter P-87 微型移液管拉制仪进行拉制，加热指数设为 300，压力指数设为 30。玻璃毛细管长度为 5 厘米，具有锥形尖端。用剪刀修剪毛细管尖端，使其内径约为 0.5 毫米。手术操作开始时，通过腹腔注射给予小鼠每千克体重100毫克的氯胺酮和每千克体重10毫克的赛拉嗪进行麻醉。在麻醉过程中，将小鼠置于37°C的培养箱中以保持体温。通过脚趾夹捏回缩反射确认动物已完全麻醉后，剃除颈部毛发，然后将小鼠固定在立体定位仪上，例如David Kink生产的此类仪器。将小鼠直肠接触加热垫，并插入直肠温度探头，以便根据小鼠体温调节加热垫的温度。使用头部适配器固定头部，用10%聚维酮碘和70%乙醇对颈部皮肤进行三次擦拭消毒，并在头部后部或枕部下方做一矢状切口。后续步骤应在解剖显微镜下使用钝头镊进行。分离皮下组织及腹侧肌（M. ventor services）和背侧头直肌（M. rectus capita dorsalis major），暴露枕骨大孔处的硬脑膜。适当使用一对微型牵开器将肌肉分开并固定。最后，将小鼠放置，使其头部与身体呈135度角。此时小鼠已准备好进行脑脊液采集。这种从胸骨Magno采集脑脊液的技术此前已有发表。在解剖显微镜下观察图C一A，硬脑膜呈半透明、清晰的倒三角形，延髓和一条主要血管透过其可见。硬脊动脉，见图C一B。可观察到延髓及其邻近脑脊液腔的循环搏动。用无菌棉签将硬脑膜擦干，将毛细管穿过硬脑膜，从脊髓背动脉侧方插入胸骨中大隐静脉。当毛细管正确插入时，阻力会发生明显变化，脑脊液随即流入毛细管。收集脑脊液后，小心取出毛细管，并使用内径为1毫米的聚乙烯管将其连接至一支3毫升注射器。将脑脊液注入一个0.5毫升的离心管中。标记管子，并立即在干冰上冷冻。待完全冻结后，将脑脊液转移至-80摄氏度冰箱中保存。刚刚演示的取样技术非常轻柔，允许在两到三个月的时间间隔内从同一只小鼠多次采集脑脊液样本。因此，在取样后应将颈部的肌肉和皮肤复位，并用缝线闭合。缝合切口后，应皮下注射约一毫升0.9% NaCl生理盐水溶液，以使小鼠恢复水分。将小鼠保持在约 37 摄氏度的环境中，直至其恢复。术后第 1 天和第 7 天监测其体重。我刚刚向您演示了如何从小鼠的脑脊髓系统中采集脑脊液。进行此操作时，需牢记三个重要事项。首先，应将小鼠的头部和身体正确固定于立体定位仪上，以便尽可能充分暴露Cy Magna的枕骨大孔。其次，使用毛细管穿刺硬脑膜时，需小心避开血管。否则，您的样本会被血液污染。最后但同样重要的是，请务必在整个操作过程中保持小鼠体温，以防止低体温。低体温不仅对小鼠有害，还可能通过诱导β蛋白产生或导致Tall蛋白低磷酸化反应而显著影响实验结果。好了，就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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一个串行收集脑脊液从池鼠标麦格纳技术

小鼠模型中通过立体定位大池途径进行治疗递送

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一种改进的小鼠麻醉状态下脑脊液采集方法

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