大鼠颈上神经节（SCG）交感神经元培养方案

该实验步骤首先从出生零天的新生大鼠中分离上颈交感神经节。每只大鼠大脑有两侧上颈交感神经节。单窝大鼠幼崽可收获约24个神经节。

神经节的解离首先进行漂洗并处理30分钟。进一步的解离通过使用火焰抛光的移液管反复吹打来完成，从而获得单细胞悬液。随后将交感神经元接种于胶原蛋白ENC包被的培养皿中。

您好，我是来自哥伦比亚大学城市学院病理学与细胞生物学系 Lloyd Green 博士实验室的 Nila Zurin。今天我们将演示如何从新生红色乳鼠的颈上神经节中分离并培养原代交感神经元。在我们实验室中，通常利用这些细胞来研究神经生长因子剥夺所诱导的细胞凋亡。

下面我们开始。在进行解剖操作前24小时，先用鼠尾胶原蛋白包被培养皿。根据实验性质的不同，可选用24孔或48孔培养板。

接下来将准备培养基和设备。这些材料和试剂可在本视频附带的文字方案中找到。需要注意的是，尿苷和5-FDU溶液应在使用前立即配制。

继续用火进行制备。在滴定步骤中抛光玻璃巴斯德吸管。将玻璃吸管的尖端在火焰中旋转数秒，使其变细并光滑。

开口火抛光操作应在无菌细胞培养罩内进行。开始解剖前，收集出生后第0至第1天的新生大鼠幼崽。用70%乙醇快速擦拭新生大鼠幼崽以减少污染。

断头后，将头部腹面朝上放置于解剖垫上，尾端朝向操作者。应能清晰看到被切断的气管。使用无菌注射针以如下方式将断离的头部固定在解剖垫上。

将一根针从口腔顶部穿入蜡盘，再将第二根针从切断的脊髓处穿入蜡盘。将解剖蜡盘移至显微镜下，通过目镜观察，用两对镊子清除气管周围的皮肤和脂肪组织。注意操作深度，避免过深，此时可在气管两侧看到一对几乎相互平行排列的肌肉。

解剖过程中，需使用无菌巴斯德吸管将冷的无菌 PBS 或冷的无血清 RPMI 1640 培养基滴加至组织上，以冲洗掉多余的血液。冲洗可进行一次或多次，具体次数取决于操作速度。随后用镊子先剪除并移去一侧的肌肉组织。

一旦移除肌肉，颈动脉便会显露出来。该动脉与气管并行，并分叉成形似“Y”形的带状结构。此分叉是一个重要的解剖标志，一旦找到该位置，便相对容易定位上颈交感神经节。

在最靠近内侧的一端切断动脉，并用镊子轻轻提起。动脉的另一端保持连接。完成此操作后，上颈神经节将变得可见。

应观察到该组织呈杏仁状，外观光滑，为一小块松散附着于动脉分叉处的组织，并可见细线状的节前和/或节后神经纤维连接。使用第二把镊子轻轻分离颈上神经节，并将其置于含有冷的无血清RPMI 1640培养基的小型35毫米培养皿中。接着，按照相同的操作步骤，从气管另一侧取出对侧的神经节。

所有神经节被分离出来后，应尽可能去除多余的组织。通过显微镜观察，可见神经节上附着有颈动脉周围的脂肪或其他组织，可用镊子小心剥离这些不需要的材料。同时剪除神经节前和/或神经节后的连合纤维。

每个神经节约含有10,000个神经元。神经元接种后，将重新生长出神经突起。随后将神经节置于含有RPMI 1640培养基的无菌15毫升圆锥形聚丙烯管中。

接下来，建立交感神经元培养。将神经节在200 G条件下离心两分钟，并弃去上清液。将神经节重悬于0.5至1毫升的0.25%胰蛋白酶溶液中，然后置于37摄氏度水浴或培养箱中30分钟，以促进神经节内细胞的解离。

30分钟后，加入10毫升完全培养基，以稀释并中和胰蛋白酶。随后将溶液在200 ×g下离心2分钟。弃去上清液，将神经节重悬于2毫升终末培养基中。

使用一个预先制备好的、开口较宽的火焰抛光移液管尖端，通过上下吹打神经节20次，进一步解离细胞。然后将试管置于冰上数分钟。接着，再次对移液管进行火焰抛光，使开口变得更窄。

移液管冷却后，再吹打组织20次。此时培养基会逐渐变得浑浊，表明细胞正在被解离。根据细胞解离情况，此步骤可再重复一至两次。

一段时间后，神经节将解离为神经元，管中不再可见完整的神经节。此时可能仍存在一些未完全解离的组织材料。将离心管置于冰上静置数分钟，使未解离的碎片沉降至管底。

除约50微升上清液外，其余上清液被小心收集并转移至另一管中。底部保留50微升，以防止未解离的碎片被转移。向含有解离细胞的管中加入更多终末培养基。

添加的终末培养基体积取决于用于培养神经元的培养板类型。例如，若使用24孔板，则每孔加入0.5毫升终末培养基，每孔接种一个神经节。

典型的大鼠一窝产仔为12只幼鼠，可获得24个神经节。这足以接种1块24孔板，最终培养基总体积为12毫升。在最终培养基中使用尿苷5-FDU可抑制胶质细胞及其他少数细胞类型的增殖，并促进其死亡。

培养过程中，每隔 48 小时更换三分之二的培养基，补充新鲜的 RPMI 培养基，并添加 1% 马血清以及 NGF、尿苷和五氟脱氧尿苷（FDU）。最初，培养物中含有交感神经元，这些神经元呈圆形，无突起。

短神经元在解剖后24小时变得可见，并随着时间推移逐渐变得更加密集且分支增多。我们刚刚向您展示了如何从新生大鼠颈上神经节中分离并培养原代交感神经元。进行此操作时，务必注意以下几点：首先，需耐心细致地清理神经节，彻底去除所有碎片、血管和脂肪组织。

此步骤对于确保培养物基本均一且不含其他类型细胞至关重要。其次，在解离步骤中需保持耐心，充分分离神经元，避免其聚集成较大团块。一旦神经元贴附到培养板上，若存在较大团块将给后续操作带来困难。

在进行神经元横切或感染等下游实验时，免疫染色也可能受到阻碍，任何需要计数神经元的实验也将难以开展。最后，培养基中无需添加青霉素-链霉素。每次换液时均添加青霉素-链霉素并无必要，仅需在细胞初次接种时添加一次即可。

每次更换培养基时，务必向其中添加新鲜的尿苷五氟脱氧尿苷（FDU）。我们实验室曾采用交感神经元培养来研究神经生长因子撤除后引发的细胞凋亡。就这样。

感谢观看，祝您的实验顺利。