Genom-Assemblierung und -Annotation

Das gesamte Genom eines Organismus kann nicht in kontinuierlichen Sequenzen sequenziert werden - selbst die neueste Generation von Sequenzierungstechnologien erzeugt fragmentierte Daten aus Tausenden von kurzen DNA-Fragmenten mit einer Länge von 50-1000 bp.

Diese kurzen DNA-Sequenzen - sogenannte Reads - müssen zusammengesetzt werden, um die vollständige Sequenz eines Genoms in einem Prozess zu rekonstruieren, der als Genomassemblierung bezeichnet wird.

Bei jeder Genomassemblierung der nächsten Generation gibt es vier Hauptschritte: Rohdatenanalyse, Contig-Assemblierung, Gerüstbau und schließlich das Schließen der Lücke.

Der erste Schritt besteht darin, die gewonnenen Rohdaten auf ihre Qualität hin zu analysieren - und dann jegliche Kontamination, verzerrte Daten oder Lesevorgänge von schlechter Qualität mit einer großen Anzahl unbekannter Nukleotide zu eliminieren.

Als Nächstes werden die sauberen Lesevorgänge getrimmt, um die Adaptersequenzen von ihren Enden zu entfernen. Alle Basen an den Fragmentenden, die den Qualitätsschwellenwert nicht überschreiten, werden ebenfalls gekürzt.

Dann wird ein gut geeignetes Assemblierungswerkzeug verwendet, um die Reads basierend auf den überlappenden DNA-Abschnitten zu zusammenhängenden Sequenzen - sogenannten Contigs - zusammenzusetzen.

Die vergleichende Genomassemblierung kann verwendet werden, wenn ein Referenzgenom eines eng verwandten Organismus zur Verfügung steht, um die Rekonstruktion des neuen Genoms zu steuern. Hier werden die Reads mit dem Referenzgenom abgeglichen, was ein Layout für weitere Schritte in der Genomassemblierung bietet.

Alternativ muss die De-novo-Genomassemblierung in Abwesenheit eines Referenzgenoms durchgeführt werden. Hier werden die überlappenden Lesevorgänge verwendet, um die Sequenzen in längere Contigs auszurichten.

Im nächsten Schritt werden die gepaarten Short Reads – das sind überhängende Reads am Ende der Contigs – für das Gerüst des Genoms verwendet.

Die Lücken zwischen den benachbarten Contigs werden mit Ns gefüllt, falls unbekannte Sequenzen vorhanden sind. Wenn jedoch lange Lesevorgänge mit einer Länge von mehr als 1 KB verwendet werden, um Contigs miteinander zu verbinden, können die Lücken mit tatsächlichen Sequenzen gefüllt werden.

Das Ergebnis ist ein assembliertes Genom, das dann mit Hilfe automatisierter Werkzeuge annotiert werden muss – ein Prozess, der als Genom-Annotation bezeichnet wird.

Die beiden Hauptziele der Genomannotation sind die Vorhersage der Genstruktur und der Genfunktion, die allgemein als strukturelle Annotation bzw. funktionelle Annotation bekannt ist.

Während die strukturelle Annotation zur Identifizierung der genomischen Elemente wie kodierende Regionen, regulatorische Motive usw. führt, hilft die funktionelle Annotation, die biologische Funktion dieser Strukturelemente, insbesondere der proteinkodierenden Gene, korrekt zu identifizieren.

Genomannotationstools verwenden verfügbare Daten, einschließlich bekannter Transkripte, Protein- oder Signalsequenzen, vorhergesagter Gene aus anderen sequenzierten Genomen oder Signaturen konservierter Domänen, als Referenzen für jede neue Annotation.

Sobald die Software diese verfügbaren Daten mit dem Genomentwurf abgeglichen hat, müssen sie entweder manuell oder mit Hilfe von Annotationswerkzeugen gefiltert und poliert werden, um einen endgültigen Satz von Genannotationen zu erhalten.