Enzymaktivität
- Baseline Peroxidase Enzym Experiment
- Um zu beginnen, muss die Ausgangsbasis für die Peroxidase-Enzymreaktion bestimmt werden. Stellen Sie das Substrat her, indem Sie 7 ml destilliertes Wasser in ein sauberes Reagenzglas geben und dann 0,2 ml Guajakol hinzufügen. Hinweis: Guajakol ist ein farbverändernder Indikator, der mit fortschreitender Enzymreaktion gelb-orange wird.
- Fügen Sie als Nächstes 0,3 ml 0,1 % H2O2 hinzu.
- Beschriften Sie mit einem Marker das Substrat des Reagenzglases und bedecken Sie das Röhrchen dann mit einem Stück Siegelfolie.
- Halten Sie den Deckel fest und drehen Sie das Rohr viermal um, um den Inhalt des Rohrs zu mischen.
- In ein zweites Reagenzglas geben Sie 6,0 mL destilliertes Wasser und 1,5 mL Rübenperoxidase und beschriften Sie dieses Röhrchen mit "Enzym".
- Decken Sie diese Tube mit einem neuen Stück Siegelfolie ab und mischen Sie diese Lösungen durch vier Inversionen, wie zuvor beschrieben (Schritt 4).
- Wenn beide Röhrchen gemischt wurden, stellen Sie einen Timer auf die Bank neben das Reagenzglasgestell und gießen Sie dann den Inhalt aus dem Substratröhrchen in das Enzymröhrchen, wobei Sie darauf achten, keine Flüssigkeit zu verschütten.
- Gießen Sie als Nächstes das gesamte Volumen aus dem Enzymröhrchen zurück in das Substratröhrchen, um die Lösungen gründlich zu mischen und das Substratröhrchen mit einem weiteren Stück Siegelfolie zu bedecken.
- Legen Sie das Reagenzglas in das Gestell und starten Sie den Timer.
- Beobachten Sie die Farbe im Substratrohr nach dem Mischen bei 0, 1, 2, 3, 4 und 5 Minuten.
- Um die relative Farbänderung und die Reaktionsgeschwindigkeit zu quantifizieren, gleichen Sie die beobachtete Farbe mit der nächstgelegenen Farbe im Standard ab. HINWEIS: Das Aufnehmen eines Fotos der beobachteten Farbintensität an jedem Abtastpunkt kann die Aufzeichnung der Ergebnisse erleichtern.
- Notieren Sie die Farben, die Sie in der Tabelle sehen. Klicken Sie hier, um Tabelle 1 herunterzuladen
- Untersuchung der Wirkung des pH-Werts auf die Peroxidase-Aktivität
- HYPOTHESEN: In dieser Übung lautet die experimentelle Hypothese, dass die Reaktionsgeschwindigkeit bei einem mittleren neutralen pH-Wert ein Maximum oder Optimum erreicht und dass diese Raten höher oder ungefähr gleich der Ausgangsrate sind. Die Nullhypothese ist, dass es keine Unterschiede in den Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen der Ausgangs- und der pH-Behandlung geben wird.
- Beschriften Sie zunächst sechs saubere Reagenzgläser für jeden der sechs pH-Pufferstufen 3 - 8 und das Wort "Enzym".
- Fügen Sie als Nächstes 6 ml der entsprechenden pH-Pufferlösungen hinzu, die von Ihrem Dozenten in jedes der Reagenzgläser gegeben wurden.
- Geben Sie dann 1,5 ml der Rübenperoxidase in jedes Röhrchen und achten Sie darauf, die Pipette nicht mit der Pufferlösung zu verunreinigen.
- Decken Sie die Enzymröhrchen mit Siegelfolie ab und drehen Sie jedes Röhrchen vorsichtig um, um den Röhrcheninhalt zu mischen.
- Wie im Basisreaktionsexperiment beschrieben, stellen Sie die Substrate für diese Reaktionen her, indem Sie 7 mL destilliertes Wasser, 0,2 mL Guajakol und 0,3 mL 0,1 % H2O2 zu sechs neuen sauberen Reagenzgläsern hinzufügen.
- Beschriften Sie als Nächstes sechs weitere saubere Reagenzgläser mit den pH-Werten 3 - 8 und dem Wort "Lösung" und halten Sie einen Timer bereit.
- Gießen Sie schnell ein Substratröhrchen und ein pH-Röhrchen in das entsprechende Lösungsröhrchen. Wiederholen Sie diesen Schritt für jeden der verschiedenen pH-Werte.
- Decken Sie dann die Röhrchen mit Siegelfolie ab und mischen Sie jedes Röhrchen mit vier Inversionen. Legen Sie jedes Röhrchen in ein Röhrchengestell, während es gemischt wird.
- Beobachten Sie die Farbe in jeder Röhre zum Zeitpunkt 0 und starten Sie sofort den Timer. Beobachten Sie weiterhin die Farbe in jeder Tube in jedem Minutenintervall, bis zu 5 Minuten.
- Verwenden Sie in jedem Intervall den Farbcode in der Norm, um die beobachteten Farben in Ihrer Tabelle aufzuzeichnen.
- Untersuchung des Einflusses der Temperatur auf die Peroxidase-Aktivität
- HYPOTHESEN: In dieser Übung lautet die experimentelle Hypothese, dass die Reaktionsgeschwindigkeit ein Optimum über Raumtemperatur oder 23 °C, aber unterhalb der Enzymdenaturierungsrate erreicht und dass dieses Maximum höher ist als die Ausgangsrate. Die Nullhypothese ist, dass es keine Unterschiede in den Reaktionsgeschwindigkeiten zwischen der Basis- und der Temperaturbehandlung geben wird.
- Füllen Sie ein 800-ml-Becherglas etwa zur Hälfte mit Eis und gießen Sie kaltes Wasser in das Becherglas, um ein Eisbad zu erzeugen. Beschriften Sie dieses Becherglas mit "Eis".
- Beschriften Sie dann vier neue 600-ml-Becher mit den gleichen Temperaturen wie Ihre Substratröhrchen und fügen Sie jeweils 150 mL Leitungswasser hinzu.
- Bringen Sie die Becher mit einer Heizplatte und einem Thermometer auf 25, 35, 45 und 60 °C, wie auf den Etiketten angegeben.
- Bereiten Sie fünf weitere Paare von Substrat- und Enzymröhrchen vor, wie für die Basisreaktion beschrieben, indem Sie destilliertes Wasser im Enzymröhrchen anstelle eines pH-Puffers verwenden.
- Beschriften Sie die Substratröhrchen mit "Ice", "25 °C", "35 °C", "45 °C" und "60 °C".
- Wenn alle Wasserbäder ihre entsprechenden Temperaturen erreicht haben, mischen Sie das Substrat und die Enzymlösungen miteinander, indem Sie zuerst den Inhalt jedes Substratröhrchens in ein Enzymröhrchen gießen und dann den Inhalt des Enzymröhrchens zurück in das Substratröhrchen gießen.
- Decken Sie die Substrattuben mit Siegelfolie ab und beobachten Sie die Farben zum Zeitpunkt 0.
- Stellen Sie dann die Röhrchen in die entsprechenden Becherbäder, basierend auf dem Temperaturetikett, das jeder Röhrchen gegeben wurde, und starten Sie einen Timer.
- Nehmen Sie für jedes 1-Minuten-Intervall die Röhren aus dem Wasser und notieren Sie ihre Farbe, wobei Sie den Stabdard als Referenz verwenden.
- Legen Sie sie dann in ihre Badewannen, bis jeder Zeitpunkt, bis zu 5 Minuten, aufgezeichnet wurde.
- Ergebnisse
- Um die Basislinie für die Reaktion zu bestimmen, stellen Sie die Änderung der Farbintensität über die Zeit grafisch dar. HINWEIS: Die Anzahl der Einheiten, um die sich die Farbe über den Zeitraum von 5 Minuten erhöht hat, dient als Basisreaktionsrate für den relativen Vergleich.
- Stellen Sie nun den Unterschied in der Farbintensität im Vergleich zu den pH-Werten dar, die im ersten Experiment verwendet wurden.
- Fügen Sie die Baseline zum Vergleich hinzu und bestimmen Sie dann, ob die optimale Reaktionsgeschwindigkeit höher, niedriger oder gleich der Baseline war.
- Bestimmen Sie anhand dieses Diagramms den optimalen pH-Wert für die Reaktion. Hinweis: Die Reaktion tritt möglicherweise nicht bei jedem pH-Wert auf. Der optimale pH-Wert für das Peroxidase-Enzym liegt typischerweise im Bereich von 6 - 7. Wenn Sie das Enzym einem Substrat mit unterschiedlichem pH-Wert aussetzen, werden Sie einen Abfall der Reaktionsgeschwindigkeit feststellen, wenn der pH-Wert des Enzyms basischer wird, wodurch das Enzym instabiler wird.
- Zum Schluss stellen Sie den Unterschied in der Farbintensität im Laufe der Zeit für die verschiedenen Temperaturen, die im zweiten Experiment verwendet wurden, grafisch dar, indem Sie zum Vergleich dieselbe Ausgangslinie verwenden.
- Bestimmen Sie anhand dieses Diagramms die optimale Temperatur für die Reaktion und vergleichen Sie sie mit der Basislinie. HINWEIS: Die Reaktion tritt möglicherweise nicht bei jeder Temperatur auf. In diesem Experiment scheint die Reaktion bei etwa 45 °C am effizientesten zu sein, und oberhalb davon beginnt das Peroxidase-Enzym zu denaturieren. Aus diesem Grund sollte es im 60 °C Becherglas nicht zu einer Farbveränderung kommen. Die Reaktionsgeschwindigkeit verlangsamt sich auch im Eisbad oder stoppt sie, da nicht genügend Energie für das Enzym vorhanden ist, um die Reaktion zu katalysieren.