15.12: Sanger-Sequenzierung

Für bestimmte Experimente oder Diagnosen kann es notwendig sein, die Nukleotidsequenz des gesamten Genoms eines Organismus zu erhalten, um ein tieferes Verständnis der vorhandenen Gene oder Allele, ihrer Funktion und der damit verbundenen Krankheiten zu erlangen. Dies kann durch DNA-Sequenzierung erreicht werden.

Zwei bekannte traditionelle DNA-Sequenzierungstechniken sind die Sanger-Sequenzierungsmethode und die Maxam-Gilbert-Methode.

Bei der Sanger-Sequenzierung – auch bekannt als Kettenterminierung oder Didesoxynukleotidsequenzierung – wird die zu sequenzierende reine Template-DNA in Gegenwart geeigneter Primer, dNTPs und modifizierter Basen, so genannter Dideoxynukleotide oder ddNTPs, PCR amplifiziert.

Den Didesoxynukleotiden fehlt die Hydroxylgruppe der Desoxynukleotide, was ihre Fähigkeit einschränkt, Phosphodiesterbindungen mit benachbarten Nukleotiden zu bilden.

Jedes Didesoxynukleotid ist außerdem mit einer anderen Fluoreszenzmarkierung markiert, um den Nachweis zu erleichtern.

Der erste Schritt besteht darin, die Matrizen-DNA in eine einzelsträngige DNA zu denaturieren.

Dann, wenn die Primer an die interessierende Region binden, beginnt die DNA-Polymerase, dem DNA-Strang neue Nukleotide hinzuzufügen und baut gelegentlich ein Didesoxynukleotid anstelle eines Desoxynukleotids ein – was die DNA-Amplifikation beendet.

Das Ergebnis sind DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die jeweils mit einem markierten Didesoxynukleotid enden.

Diese DNA-Fragmente werden dann auf ein Kapillargel laufen lassen, um sie auf der Grundlage ihrer Größe zu trennen, und die Emissionsspektren jedes dieser Fragmente werden durch automatisierte Software analysiert, um die genetische Sequenz der gewünschten DNA zu entschlüsseln.