32.10: Immunpräzipitation

Immunpräzipitation (IP) ist eine weit verbreitete Technik, bei der Protein-Antikörper-Wechselwirkungen verwendet werden, um Proteine oder Proteinkomplexe in ihrem nativen Zustand zu isolieren und so Protein-Protein-Wechselwirkungen, quaternäre Strukturen oder supramolekulare Komplexe zu untersuchen. Verschiedene Modifikationen der Technik, einschließlich Chromatin-IP, Vernetzungs-IP und Fluoreszenz-IP, werden häufig verwendet.

Chromatin-Immunpräzipitation

Die Chromatin-Immunpräzipitation, auch bekannt als ChIP, wird verwendet, um Protein-DNA- oder Protein-RNA-Wechselwirkungen zu untersuchen. Es ist eine wichtige Technik zur Untersuchung wichtiger zellulärer Prozesse wie Gentranskription, DNA-Replikation, Rekombination und Reparatur, Zellzyklusprogression und Epigenetik. Es ist auch hilfreich, die in vivo Position der Bindungsstellen verschiedener Transkriptionsfaktoren, Histone und anderer regulatorischer Proteine zu identifizieren.

Zu den wichtigsten Schritten bei ChIP gehören Fixierung, Beschallung, Immunpräzipitation und Analyse. Dabei wird das Zielprotein mit der DNA unter Verwendung eines Fixiermittels wie Formaldehyd vernetzt, gefolgt von Ultraschall oder enzymatischer Hydrolyse, um kleinere Chromatinfragmente zu erhalten. Die Technik verwendet dann hochaffine Antikörper, die spezifisch gegen das interessierende Protein sind, um die an das Protein gebundene DNA in einer Immunpräzipitationsreaktion einzufangen. Die Vernetzung wird dann mit hoher Hitze, hoher Salzkonzentration und Proteinase K rückgängig gemacht, um die DNA aus assoziierten Proteinen freizusetzen. Die DNA wird weiter gereinigt, um sie für die Analyse vorzubereiten.

Vernetzung der Immunpräzipitation

der Cross-Linking-Immunpräzipitation (CLIP) werden die Regionen der Proteinbindungsstellen auf endogener RNA identifiziert, indem sie in der aktiven Transkriptionsphase mitpräzipitiert werden. RNA-Moleküle werden mit Proteinen vernetzt, um sie fest zusammenzuhalten und ihren Abbau zu verhindern. Das Verfahren für den Abbau und die Isolierung der Komplexe ist ähnlich wie bei ChIP. Diese Technik wird verwendet, um die Interaktion von RNA mit RNA-bindenden Proteinen und deren Modifikationen in verschiedenen biologischen Systemen zu untersuchen.

Einschränkungen des geistigen Eigentums

Obwohl Immunpräzipitationstechniken dazu neigen, die Anzahl der Reinigungsschritte zu reduzieren, hat sie gewisse Einschränkungen. Die Antikörper bindenden rekombinanten bakteriellen Proteine, Proteine A oder G, die an Agarosekügelchen konjugiert sind, und Antikörper, die in dem Verfahren verwendet werden, können einer unspezifischen Bindung unterzogen werden, wodurch Kontaminanten in die gereinigte Proteinzubereitung eingeführt werden. Auch die Immobilisierung von Antikörpern auf Kügelchen erfordert eine Optimierung und ist zeitaufwändig. Das Waschen der Kügelchen nach dem Antigen-Antikörper-Komplex ist kritisch, aber es besteht die Möglichkeit, dass das Zielprotein in diesem Schritt verloren geht.