33.4: Immunfluoreszenzmikroskopie

Ein Fluoreszenzmikroskop verwendet fluoreszierende Chromophore, sogenannte Fluorochrome, die Energie von einer Lichtquelle absorbieren und diese Energie dann als sichtbares Licht abgeben können. Zu den Fluorochromen gehören natürlich fluoreszierende Substanzen (wie Chlorophylle) und fluoreszierende Farbstoffe, die der Probe zugesetzt werden, um einen Kontrast zu erzeugen. Farbstoffe wie Texas Red und FITC sind Beispiele für Fluorochrome. Weitere Beispiele sind die Nukleinsäurefarbstoffe 4′,6′-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) und Acridinorange.

Das Mikroskop bestrahlt die Probe mit kurzwelliger Anregung, wie z. B. ultraviolettem oder blauem Licht. Die Chromophore absorbieren das Anregungslicht und emittieren sichtbares Licht längerer Wellenlängen. Das Anregungslicht wird dann herausgefiltert (auch weil ultraviolettes Licht für die Augen schädlich ist), so dass nur sichtbares Licht durch die Okularlinse dringt und ein Bild der Probe in hellen Farben vor dunklem Hintergrund entsteht.

Fluoreszenzmikroskope können Krankheitserreger identifizieren, bestimmte Spezies in einer Umgebung finden oder die Positionen bestimmter Moleküle und Strukturen innerhalb einer Zelle finden. Es wurden auch Ansätze entwickelt, um lebende von toten Zellen zu unterscheiden, basierend darauf, ob sie bestimmte Fluorochrome aufnehmen. Manchmal werden mehrere Fluorochrome an derselben Probe verwendet, um unterschiedliche Strukturen oder Merkmale zu zeigen.

Eine der wichtigsten Anwendungen der Fluoreszenzmikroskopie ist die Immunfluoreszenz, mit der bestimmte Mikroben identifiziert werden, indem beobachtet wird, ob Antikörper an sie binden. (Antikörper sind Proteinmoleküle, die das Immunsystem produziert und die sich an bestimmte Krankheitserreger anheften, um sie abzutöten oder zu hemmen.) Bei dieser Technik gibt es zwei Ansätze: den direkten Immunfluoreszenz-Assay (DFA) und den indirekten Immunfluoreszenz-Assay (IFA). Bei DFA werden spezifische Antikörper (z. B. solche, die auf das Tollwutvirus abzielen) mit einem Fluorochrom gefärbt. Enthält die Probe den Zielerreger, kann man unter dem Fluoreszenzmikroskop beobachten, wie die Antikörper an den Erreger binden. Hierbei handelt es sich um eine primäre Antikörperfärbung, da die gefärbten Antikörper direkt an den Erreger binden.

Bei der IFA werden Sekundärantikörper mit einem Fluorochrom anstelle von Primärantikörpern gefärbt. Sekundäre Antikörper binden nicht direkt an den Organismus, sondern binden an Primärantikörper. Wenn die ungefärbten Primärantikörper an den Erreger binden, kann beobachtet werden, wie die fluoreszierenden Sekundärantikörper an die Primärantikörper binden. Somit werden die Sekundärantikörper indirekt an den Erreger gebunden. Da oft mehrere Sekundärantikörper an einen Primärantikörper binden können, erhöht IFA die Anzahl der fluoreszierenden Antikörper, die an die Probe gebunden sind, was die Visualisierung ihrer Merkmale erleichtert.