Photo-induzierte Quervernetzung von unmodifizierten Proteine (picup) ermöglicht die Charakterisierung des Oligomers Größenverteilung in metastabilen Protein-Mischungen. Wir zeigen, Anwendung picup zu drei Vertreter amyloidogene Peptide der 40 - und 42-Rückstand bildet der Amyloid-β-Protein und Calcitonin, und eine Kontrollgruppe Peptid Wachstumshormon-Releasing-Faktor.
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Methodenartikel
Photo-induzierte Vernetzung von unmodifizierten Proteins (picup) zu amyloidogene Peptide Applied
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Montage der amyloidogene Proteine in toxischen Oligomere ist ein wegweisendes Ereignis in der Pathogenese der Fehlfaltung Erkrankungen, darunter Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit, erblich amyotrophe Lateralsklerose, und Typ 2 Diabetes. Aufgrund der metastabilen Charakter dieser Protein-Baugruppen, ist es schwierig, ihre Oligomer Größenverteilung quantitativ zu erfassen mit klassischen Methoden wie Elektrophorese, Chromatographie, Fluoreszenz oder dynamische Lichtstreuung. Oligomere von amyloidogene Proteine existieren als metastabile Mischungen, in denen die Oligomere in Monomere dissoziieren und assoziieren zu größeren Baugruppen gleichzeitig. Picup stabilisiert Oligomer Populationen durch kovalente Vernetzung und wann mit Fraktionierung Methoden, wie Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder Größenausschlusschromatographie (SEC) kombiniert wird, liefert picup Schnappschüsse des Oligomers Größe Distributionen, die vor dem Kreuz gab Vernetzung. Daher ermöglicht picup Visualisierung und quantitativen Analyse von metastabilen Protein Populationen und kann zur Montage und entschlüsseln Beziehungen zwischen Sequenz Modifikationen und Oligomerisierung überwachen
Protokoll
1. Peptide Vorbereitung
- Abwiegen ~ 100-200 pg lyophilisierten Peptids unter Verwendung einer Mikrowaage und Transfer in beschriftete, Silizium beschichtet, low-Adsorbens Mikrozentrifugenröhrchen. Hier verwenden wir die menschliche Sequenzen von Aβ40, Aß42, Calcitonin und GRF.
- Hier verwenden wir Peptide mit 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) vorbehandelt, um eine homogene, Aggregat-freie Präparate zu erhalten. Dieser Schritt ist notwendig, weil vorgeformte Aggregate induzieren schnelle Aggregation von amyloidogenen Proteine, die in schlechten Reproduzierbarkeit unter Versuchen 5 führen. Andere Methoden wie Filtration und SEC können....
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Diskussion
Picup war ursprünglich eine stabile Protein-Komplexe 2-Studie entwickelt. Die Methode wurde später auf quantitative Studie von metastabilen Amyloid-Protein-Baugruppen, darunter Aß 10, Prionen und krankheits-assoziierte PrP Sc 11 und α-Synuclein 12 aufgebracht. Die wichtigsten Faktoren, die bei der Gestaltung eines picup Experiment werden müssen, sind das Reagenz Stöchiometrie, Bestrahlungszeit und Probenvorbereitung. Die ersten beiden Probleme erfordern empirische Optimierung, während die letztgen.......
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Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AG027818 und AG030709 von NIH / NIA, 2005/2E aus dem Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 vom Alzheimer Association und 07-65798 vom California Department of Public Health unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W-Glühlampe | Sonstiges | Dolan-Jenner Industries | Modell 170-D | Die von der Lampe erzeugte Wärme d–beeinflusst Proben bei kurzen Inkubationszeiten nicht. |
| 35-mm-SLR-Kameragehäuse | Werkzeug | Pentax | SP500-Modell | In unseren Einstellungen ist ein Balgen an das Gehäuse der Kamera angebracht, um eine geeignete Kammer für die Bestrahlung der Probe bereitzustellen, die 10 cm von der Lichtquelle entfernt platziert ist. |
| Klare, dünnwandige PCR-Röhrchen | Sonstiges | Eppendorf | 951010006, bezogen von Fisher L22-003-24 | |
| Glasvials (1,8 mL) | Sonstiges | Kimble Chase | 60940A 2, geliefert von Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagenz | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagenz | TCI America | H0424 | Im Abzug verwenden. |
| Aβ40 und Aβ42 | Reagenz | UCLA Biopolymere Laboratorium | ||
| Calcitonin | Reagenz | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2′-Bipyridyl)dichlorruthenium(II)-Hexahydrat | Reagenz | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortexen Sie, bis die Lösung klar ist. Bedecken Sie das RuBpy-Röhrchen mit Aluminiumfolie, um das Reagenz vor Umgebungslicht zu schützen. RuBpy wird jedes Mal frisch hergestellt und sollte innerhalb von 48 h verwendet werden. |
| Ammoniumpersulfat | Reagenz | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortexen Sie, bis die Lösung klar ist. APS wird jedes Mal frisch hergestellt und sollte innerhalb von 48 h verwendet werden. |
| β-Mercapto–Ethanol | Reagenz | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Kann verwendet werden, wenn eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt wird. |
| Novex Tricin SDS-Probe-Puffer (2x) | Reagenz | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Zelle | Werkzeug | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricin-Gele (10–20 %) | Sonstiges | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Laufpuffer (10x) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
Referenzen
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T.
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Nachdrucke und Genehmigungen
