Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Zusammenfassung

Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Hier zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid mit Standard-Reagenzien einzuführen.

Zusammenfassung

Seite Mutagenese ganzer Plasmide ist ein einfacher Weg, um etwas anders Variationen eines Original-Plasmid zu erzeugen. Mit dieser Methode wird die geklonte Zielgen kann durch Substitution, Deletion oder Insertion von wenigen Basen direkt in ein Plasmid verändert werden. Es funktioniert einfach durch die Verstärkung der gesamten Plasmid, in einem nicht PCR-basierte Thermocycling Reaktion. Während der Reaktion mutagene Primer, die das gewünschte Mutation in die neu synthetisierte Plasmid integriert. In diesem Video-Tutorial zeigen wir eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Basensubstitutionen in ein Plasmid einzuführen. Das Protokoll arbeitet mit Standard-Reagenzien und ist unabhängig von kommerziellen Kits, die oft sehr teuer. Anwendung dieses Protokolls können die Gesamtkosten einer Reaktion auf ein Achtel von dem, was es kostet mit einigen der kommerziellen Kits reduzieren. In diesem Video, das wir auch auf kritischen Schritte Kommentar während des Prozesses und geben detaillierte Anweisungen, wie die mutagene Primer-Design.

Protokoll

Das Prinzip der Methode:

Die Mutagenese des gesamten Plasmide erklärt in diesem Video ist eine Mutagenese-Methode, die Sie zu einem geklonten Zielgen durch Substitution, Deletion oder Insertion von wenigen Basen direkt in ein Plasmid ändern können. Es funktioniert durch die Verstärkung der gesamten Plasmid, in einem nicht PCR-basierte Thermocycling Reaktion. Während der Reaktion mutagene Primer, die die gewünschten Mutation in Form von Fehlanpassungen der ursprünglichen Plasmid, werden in die neu synthetisierte Plasmid integriert. Nach dem Entfernen des ursprünglichen Plasmid aus der Reaktion des mutierten Plasmid wird in E. verwan....

Diskussion

Seite Mutagenese ist eine Mutagenese-Verfahren, das eine schnelle Möglichkeit, ein Gen von einem Plasmid durchgeführt mutieren zur Verfügung stellt. Die gesamte Reaktion kann in nur einem Tag durchgeführt werden. Mit dieser Methode wird es brauchen nur ein Paar kostenlose Primer, die die gewünschten Mutationen und das Korrekturlesen Polymerase wie Pfu-Polymerase. Die neu synthetisierte Plasmid kann von den Eltern Plasmid durch Verdauen der Reaktion mit dem Restriktionsenzym DpnI getrennt werden. Dieses Enzym verdaut nur.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Pfu-Polymerase (rekombinant oder nativ)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP-Mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI oder DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
Primer	Invitrogen		entsalzt