Large Volume (20L +) Filtration von Coastal Meerwasser Proben

Zusammenfassung

Das Video dokumentiert großes Volumen (≥ 20 L) Filtration von mikrobieller Biomasse, die zwischen 0,22 &mgr; m und 2.7μm im Durchmesser, aus der Wassersäule.

Zusammenfassung

Der Workflow beginnt mit der Sammlung von der Küste Meeresgewässer für nachgeschaltete mikrobielle Gemeinschaft, Nährstoff-und Spurengasen analysiert. Für dieses Verfahren wurden Proben aus dem Deck der HMS John Strickland, die in Saanich Inlet gesammelt. Das Video dokumentiert großes Volumen (≥ 20 L) Filtration von mikrobieller Biomasse, die zwischen 0,22 &mgr; m und 2.7μm im Durchmesser, aus der Wassersäule. Zwei 20L Proben können gleichzeitig gefiltert werden über ein einziges Aggregat mit vier rotierenden Köpfen ausgestattet. Die Filtration wird in das Feld, auf ausgedehnte Reisen gemacht, oder unmittelbar nach der Rückkehr für Tagesausflüge. Es ist wichtig, die Menge des Wassers, die durch jede Sterivex Filtereinheit aufnehmen. Um zu verhindern, Biofilmbildung zwischen Probenahme Reisen müssen alle Filteranlagen mit verdünnter HCl und VE-Wasser gespült werden und autoklaviert sofort nach Gebrauch. Dieser Vorgang dauert ca. 5 Stunden plus eine zusätzliche Stunde für aufzuräumen.

Protokoll

1. Set up des Filtrationsapparatur
   1. Zum Einrichten der Filtrationsvorrichtung, mit Hilfe einer Pinzette zu einem Grad GF / D-Filter in den Vorfilter Wohneinheit Platz. Locker ziehen Sie die Gehäuse von Hand. Als Faustregel gilt, nicht zu fest anziehen, oder das Gerät, sobald die Pumpen beginnt undicht.
   2. Ersetzen Sie den Glasballon Kappe mit dem autoklaviert Kappe und befestigt Schlauch durch vorsichtiges Einsetzen der inneren Schlauch in den Kanister ohne es zu berühren. Wenn nötig, mit Hilfe einer Pinzette, um den Schlauch in den Kanister zu führen.
   3. Führen Sie das externe Schlauch durch die Schlauchpumpe.
   4. Bringen Vorfilter Wohneinheiten bis zum Ende der beiden äußeren Rohre (dh 2 Einheiten pro Kanister). Ziehen Sie die Verbindung mit einer Zange.
2. Filtration von Meerwasser
   1. Um die Filterung des Meerwassers, auf die Pumpe einschalten und die Strömungsgeschwindigkeit zu 1. Sehen Sie, um sicherzustellen, dass das Wasser wird in die richtige Richtung gepumpt.
   2. Lassen Sie 500 ml Wasser frei fließen durch den Vorfilter-Einheit und in einem 1 L Becherglas.
   3. Schalten Sie die Pumpe und befestigen Sie eine Sterivex Filter auf den männlichen Luer-Anschluss an das freie Ende des Vorfilter-Setup. Ziehen Sie die Vorfiltergehäuse eng mit der Hand.
   4. Achten Sie bei der Vorfilter Gehäuse und an der Verbindung zwischen dem Vorfilter Gehäuse und die Schläuche, die den Ballon führt. Wenn Undichtigkeiten auftreten, schalten Sie die Pumpe aus und lösen Sie und ziehen Sie die Vorfiltergehäuse entsprechend. Schalten Sie die Pumpe wieder ein.
   5. Das Filtrat in 4 L Flaschen. Sobald sie voll sind, leeren Sie den Kolben in ein sauberes Glasballon. Achten Sie darauf, die Lautstärke durch jeden Filter geleitet beachten. Gesammelte Filtrat weiter verarbeitet werden kann, wie Filtration auf Viren.
   6. Weiter Filterung, bis kein Wasser in die Ballons übrig bleibt. Usual Filtrationszeiten Bereich zwischen 4-5 h / 20 L Kanister, allerdings hängt dies stark von der Menge der Biomasse im Wasser.
   7. Nach Filtration beendet ist, schalten Sie die Pumpe aus und trennen Sie das Sterivex Filter.
3. Lagerung von Filtern
   1. So speichern Sie die Filter, zuerst zu vertreiben restliche Wasser mit einem 30-60 ml Spritze.
   2. Mit einer Pipette 1,8 ml Lysepuffer, um den Filter, halten ~ 200 ul des Raumes in den Filter für die spätere Zugabe von Reagenzien.
   3. Verschließen Sie die untere und obere der Sterivex Filter mit einem kleinen Stück Parafilm, und beschriften Sie die Filter mit dem Datum und Identifizierung der Proben.
   4. Bewahren Sie die Filter in einer pre-markierten 50 ml Falcon-Röhrchen bei -80 ° C
   5. Entfernen Sie die Filter aus dem Gehäuse, und setzen Sie sie in beschriftete 50 ml Falcon-Röhrchen mit 2 ml Lysepuffer. Bewahren Sie diese bei -80 ° C.
4. Cleanup
   1. Für die endgültige Bereinigung, platzieren Sie den Schlauch im Inneren des Ballons wurde in einen Kolben mit 0,1 M HCl
   2. Richten Sie die Schläuche, die zum 4L Kolben in die ursprüngliche Glasballon führen.
   3. Schalten Sie die Pumpe und laufen bei 3, das Sammeln der Durchfluss durch laufen in der ursprünglichen Glasballon.
   4. Schließlich spülen Sie den Schlauch mit Wasser autoklaviert.

Repräsentative Ergebnisse: Das Ergebnis besteht aus zwei Sterivix Filter jeweils mikrobiellen Biomasse von etwa 10 L Meerwasser in der Größenordnung von 0,22 &mgr; m und 2.7μm. Dies ist in Lyse-Puffer gespeichert und bereit für die DNA-Extraktion. Darüber hinaus sammelt dieses Verfahren und konzentriert Biomasse größer als 2,7 um, auf der GF / D Vorfilter. Dies ist auch in Lyse-Puffer gespeichert und bereit für die DNA-Extraktion. Wenn zusätzliche Verarbeitungsschritte übernommen werden, kann der 0,22 &mgr; M Flow-Through nach unten konzentriert werden, um das virale Fraktion sowie zu sammeln.

Diskussion

Es ist zwingend notwendig, um abwischen Bänke und Pumpen mit einem feuchten Tuch nach dem Gebrauch an alle verbliebenen Spuren von Salzwasser, die sonst korrodieren würden Geräte zu entfernen. Obwohl das Verfahren ist einfach, kann der Zeitbedarf werden umfangreiche abhängig von der Konzentration der Biomasse oder Verunreinigungen in der Probe herausgefiltert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Peristaltikpumpe		Masterflex (Cole Palmer)	77913-20, 77200-62, 77200-04
Tygon LFL-Schlauch		Masterflex (Cole Palmer)	06429-24	Für Filtrationsapparatur
Schlauchschellen		Cole-Parmer	0683204	Für Filtrationsapparatur
1/4” x 3/16” Rohradapter		Cole-Parmer	31702-20	Für Filtrationsapparatur
Polypropylen-Vorfiltergehäuse		ADVANTEC	501200	Für Filtrationsapparatur
Metall-Luer-Verbinder (Schlauchende auf männlichen Luer-Lock)		Cole-Parmer	31507-27	Für Filtrationsapparatur
2“ Magnete			Für Filtrationsapparatur
Dreiwege-Flaschenverschlüsse				Für Filtrationsapparatur
GV 0,22 μm STERIVIX-Filter		EMD Millipore	SVGV01R5
47 mm Durchmesser, 2,7 μm GF/D-Filter		Whatman, GE Healthcare	1823047
Lysispuffer	Reagenz			0,75 M Saccharose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3)
0,1 % HCl	Reagenz			Zum Nachspülen nach der Filtration
autoklaviertes Wasser	Reagenz			Zum Nachspülen nach der Filtration