Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Zusammenfassung

Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.

Zusammenfassung

Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode basiert auf der hoch spezifische Wechselwirkung zwischen Peptid beladenen MHC und die entsprechenden T-Zell-Rezeptor. Während die Affinität eines einzelnen MHC / Peptid-Molekül ist gering, Vernetzung MHC / Peptid-Komplexe mit Streptavidin erhöht die Avidität der Interaktion, so dass ihre Verwendung als Färbereagenzien. Wegen der relativ niedrigen Frequenzen von CD4 + T-Zellen (~ 1 in 300.000 für einen einzigen Spezifität) diesen Test nutzt eine in vitro-Amplifikation Schritt zu seiner Schwelle Erkennung zu erhöhen. Mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut durch Ficoll Unterlage gereinigt. CD4 + Zellen werden dann durch negative Selektion mittels biotinylierten Antikörper-Cocktail und anti-Biotin markiert magnetische Kügelchen getrennt. Mit adhärenten Zellen aus der CD4-Zell-Fraktion als Antigen-präsentierende Zellen, CD4 + T-Zellen werden in Medien, indem eine antigene Peptid-und IL-2 erweitert. Die expandierten Zellen sind mit der entsprechenden Klasse II Tetramer durch Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde und anschließend gefärbt mit Oberfläche Antikörper wie anti-CD4, anti-CD3 und anti-CD25 gefärbt. Nach der Etikettierung können die Zellen direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Das Tetramer-positiven Zellen bilden typischerweise eine deutliche Bevölkerung unter den erweiterten CD4 +-Zellen. Tetramer-positiven Zellen sind in der Regel CD25 + CD4 und oft hoch. Da der Pegel der Hintergrundgeräusche Tetramer-Färbung kann variieren, sollten positive Färbung Ergebnisse immer auf die Färbung von den gleichen Zellen mit einem irrelevanten Tetramer verglichen werden. Mehrere Variationen dieses grundlegende Assay sind möglich. Tetramer-positive Zellen können für weitere phänotypische Analyse, Aufnahme in ELISPOT oder Proliferation Assays oder andere sekundäre Assays sortiert werden. Mehrere Gruppen haben auch Co-Färbung mit Tetrameren und entweder Anti-Zytokin-oder Anti-FoxP3 Antikörper nachgewiesen.

Protokoll

1. Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) isoliert

1. Besorgen Sie sich eine Blutprobe - Blut sollte in Spritzen oder Blut-Röhrchen gesammelt und anti-koaguliert mit Heparin (1:50 ratio) Gerinnen zu verhindern. Erwarten Sie eine Ausbeute von etwa 1 × 10 ⁶ PBMC pro ml Blut - etwa 40% davon werden CD4 positive (CD4 +) T-Zellen sein.
2. Aliquot dem Blut in 50 ml konische Röhrchen, 25 ml pro Röhrchen. Wenn Blut getrennt hat, sanft vor Aliquotierung Mix, um das Plasma zu verteilen
3. Add PBS, womit das Gesamtvolumen auf 40 ml und die Unterlage durch die Erstellung von 11 ml Ficoll, Einsetzen in Blutröhrchen und sorgfältig Entfernen der Pipet....

Diskussion

Verständnis der Rolle der CD4 + T-Zellen im Immunsystem ist von grundlegender Bedeutung. Allerdings können Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen schwer zu erkennen und zu isolieren, die mit traditionellen Methoden. Im Gegensatz dazu erlauben MHC-Klasse-II-Tetramere die direkte Visualisierung von CD4 + T-Zellen mit der gewünschten Antigen-Spezifität. Dieses Video zeigt die Isolierung, Reinigung und In-vitro-Amplifikation von CD4 + T-Zellen und deren anschließende Visualisierung mit Tetrameren. Klasse II Tetramere sind fluo.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Horizontale Laminar-Flow-Biosicherheitswerkbank der Klasse 2	Gerät	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	Oder gleichwertig
Kegelrohr, 50 mL	Gerät	VWR international	47747-182	Oder gleichwertig
1× PBS (ohne Ca/Mg)	Reagenz	Hyclone	SH30028.02	Oder gleichwertig
Ficoll-Paque PLUS	Reagenz	GE Healthcare	17-1440-03	lichtgeschützt in Alufolie verpackt
Pipettierhilfe XP	Gerät	Drummond Scientific	4-000-101	Oder gleichwertig
10-mL-Pipette	Gerät	Corning	CLS4492	Oder gleichwertig
Aerosolve-Kanister	Gerät	Beckman Coulter Inc.	359481	mit 50-mL-Einsätzen
Zentrifuge	Gerät	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	Oder gleichwertig
Transferpipetten	Gerät	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	Oder gleichwertig
Pasteur-Pipetten	Gerät	VWR international	14672-200	Oder gleichwertig
Hämolysepuffer	Reagenz	N/V	N/V	8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L Dinatrium-EDTA
Trypanblau	Reagenz	Sigma-Aldrich	T6146	0,2 % in PBS
Blutkörperchenzähler (Hämozytometer)	Gerät	VWR international	15170-208
Kegelrohr, 15 mL	Gerät	VWR international	05-527-90	Oder gleichwertig
Laufpuffer	Reagenz	N/V	N/V	PBS + 2 mM EDTA + 5 g/L BSA
MACS CD4+-T-Zell-Isolationskit II	Reagenz	Miltenyi Biotec	130-091-155	Oder gleichwertig
EasySep®-Magnet	Gerät	Stem Cell Technologies	18000
5-mL-Polypropylenrohr	Gerät	Falcon BD	352063
RPMI 1640	Reagenz	Invitrogen	22400-089	mit 25 mM HEPES
Gemischtes humanes Serum	Reagenz	N/V	N/V	Aus Spenderblut gewonnen, hitzeinaktiviert und filtriert
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)	Reagenz	Invitrogen	1570-063	Oder gleichwertig
500-mL-Flaschentopf-Filter mit 0,22-Mikron-Porengröße	Gerät	Nalge Nunc international	595-3320	Oder gleichwertig
48-Well-Platte	Gerät	Costar	3548	Oder gleichwertig
37°C-CO2-Inkubator	Gerät	Sanyo	MCO-18AIC	Oder gleichwertig
Synthetisches Peptid, 20 mg/mL	Reagenz	N/V	N/V	Maßgeschneiderte Synthese durch beliebigen Peptidlieferanten
5-mL-FACS-Röhrchen	Gerät	Falcon BD	352008	Polystyrol
Peptidbeladener MHC-Klasse-II-Tetramer (wie beschrieben)	Reagenz	N/V	N/V	Vom BRI-Tetramer-Kern hergestellt
Anti-CD3	Reagenz	BD Biosciences	347344	Oder gleichwertig
Anti-CD4	Reagenz	eBioscience	17-0049-73	Oder gleichwertig
Anti-CD25	Reagenz	eBioscience	11-0259-73	Oder gleichwertig
Facs Calibur-Durchflusszytometer	Gerät	BD Biosciences	342975	Oder gleichwertig