Visualizing Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mit MHC Klasse II Tetramere

Zusammenfassung

Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.

Zusammenfassung

Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode basiert auf der hoch spezifische Wechselwirkung zwischen Peptid beladenen MHC und die entsprechenden T-Zell-Rezeptor. Während die Affinität eines einzelnen MHC / Peptid-Molekül ist gering, Vernetzung MHC / Peptid-Komplexe mit Streptavidin erhöht die Avidität der Interaktion, so dass ihre Verwendung als Färbereagenzien. Wegen der relativ niedrigen Frequenzen von CD4 + T-Zellen (~ 1 in 300.000 für einen einzigen Spezifität) diesen Test nutzt eine in vitro-Amplifikation Schritt zu seiner Schwelle Erkennung zu erhöhen. Mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut durch Ficoll Unterlage gereinigt. CD4 + Zellen werden dann durch negative Selektion mittels biotinylierten Antikörper-Cocktail und anti-Biotin markiert magnetische Kügelchen getrennt. Mit adhärenten Zellen aus der CD4-Zell-Fraktion als Antigen-präsentierende Zellen, CD4 + T-Zellen werden in Medien, indem eine antigene Peptid-und IL-2 erweitert. Die expandierten Zellen sind mit der entsprechenden Klasse II Tetramer durch Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde und anschließend gefärbt mit Oberfläche Antikörper wie anti-CD4, anti-CD3 und anti-CD25 gefärbt. Nach der Etikettierung können die Zellen direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Das Tetramer-positiven Zellen bilden typischerweise eine deutliche Bevölkerung unter den erweiterten CD4 +-Zellen. Tetramer-positiven Zellen sind in der Regel CD25 + CD4 und oft hoch. Da der Pegel der Hintergrundgeräusche Tetramer-Färbung kann variieren, sollten positive Färbung Ergebnisse immer auf die Färbung von den gleichen Zellen mit einem irrelevanten Tetramer verglichen werden. Mehrere Variationen dieses grundlegende Assay sind möglich. Tetramer-positive Zellen können für weitere phänotypische Analyse, Aufnahme in ELISPOT oder Proliferation Assays oder andere sekundäre Assays sortiert werden. Mehrere Gruppen haben auch Co-Färbung mit Tetrameren und entweder Anti-Zytokin-oder Anti-FoxP3 Antikörper nachgewiesen.

Protokoll

1. Periphere mononukleäre Zellen (PBMC) isoliert

1. Besorgen Sie sich eine Blutprobe - Blut sollte in Spritzen oder Blut-Röhrchen gesammelt und anti-koaguliert mit Heparin (1:50 ratio) Gerinnen zu verhindern. Erwarten Sie eine Ausbeute von etwa 1 × 10 ⁶ PBMC pro ml Blut - etwa 40% davon werden CD4 positive (CD4 +) T-Zellen sein.
2. Aliquot dem Blut in 50 ml konische Röhrchen, 25 ml pro Röhrchen. Wenn Blut getrennt hat, sanft vor Aliquotierung Mix, um das Plasma zu verteilen
3. Add PBS, womit das Gesamtvolumen auf 40 ml und die Unterlage durch die Erstellung von 11 ml Ficoll, Einsetzen in Blutröhrchen und sorgfältig Entfernen der Pipette Hilfe aus der Pipette. Die Ficoll wird langsam in den Boden des Röhrchens abtropfen lassen. Sobald das Niveau angeglichen hat, langsam entfernen Sie die Pipette aus dem Blutröhrchen und entsorgen.
4. Cap der Blut-und Umzug in die Aerosolve Kanister. Schließen Sie die Kanister und Zentrifuge bei 900 × g für 20 Minuten - keine Bremse. Es ist wichtig, dass keine Bremse am Ende dieser Runde wird angewendet, wenn die Bremskraft der Schicht der Zellen stören.
5. Nach dem Spin, sollte die PBMCs bilden einen deutlichen weißen Schicht zwischen dem gelben Plasma (oben) und transparent Ficoll (unten). Vorsichtig abschöpfen weißen Blutkörperchen Schicht mit einer Transferpipette und Transfer zum neuen Rohr. Einige Plasma und Ficoll dürfen nicht in der PBMCs gezogen werden, aber vermeiden Sie die Erstellung eines der roten Zellschicht. Typischerweise werden zwei Blutröhrchen kann in einer Zelle Rohr bei diesem Schritt kombiniert werden, um das Pellet zu vergrößern.
6. Add PBS, womit das Gesamtvolumen auf 50 ml und Zentrifuge bei 500 × g für 15 Minuten - geringer Bremse in aerosolve Kanister.
7. Flüssigkeitsaufnahme mit einer Pasteurpipette, kümmert sich nicht um das Pellet stören
8. Behandeln Sie mit hämolytisch-Puffer durch Zugabe von 5-6 mL in jedes Röhrchen und sanft mischen, um Klumpen zu entfernen. Inkubieren nicht mehr als 5 Minuten.
9. Add PBS, womit das Gesamtvolumen auf 50 ml und Zentrifuge bei 230 × g für 10 Minuten - geringer Bremse. Aerosolve Kanister sind nicht mehr für diese langsamer dreht benötigt.
10. Wash zwei Mal: ​​Flüssigkeitsaufnahme mit einer Pasteurpipette, Füllrohr mit PBS und Zentrifuge bei 230 × g für 10 Minuten.
11. Vor der abschließenden Waschschritt entfernt ein Aliquot wieder suspendierten Zellen, verdünnt mit Trypanblau, und zählen mit einer Zählkammer. Diese Zellzahl bestimmen die Reagenzienvolumina in der T-Zell-Trennstufe verwendet.

2. CD4 + T-Zell-Trennung ^*

1. Flüssigkeitsaufnahme und fügen Laufpuffer auf das Gesamtvolumen bringen bis zu 40 uL pro 10 Millionen Zellen. Normalerweise braucht man 30 ul Puffer plus das restliche Pellet Volumen.
2. Übertragen Sie diese Lautstärke auf ein konisches 15 ml Tube.
3. Add-Antikörper Cocktail von der CD4 Isolation Kit - 10 uL pro 10 Millionen Zellen, Kapillarrohr, und auf Eis für 10 Minuten
4. Entfernen Rohr aus Eis, Kappe entfernen, und fügen Sie 30 ul Laufpuffer pro 10 Millionen Zellen
5. Add magnetischen Beads aus der CD4 Isolation Kit - 20 uL pro 10 Millionen Zellen, Kapillarrohr, und auf Eis für 15 Minuten
6. Add zehn Bände Laufpuffer zu waschen und bei 230 × g zentrifugieren für 10 Minuten.
7. Während der Drehung, richten Sie den Magneten und 5 ml Polypropylen-Röhrchen, in Ihrem Arbeitsbereich
8. Absaugen von Flüssigkeit aus Zellpellet 2 ml Laufpuffer und entfernen Klumpen mit einem Transferpipette
9. Mit der gleichen Übertragung Pipette Zellen in die 5-ml-Röhrchen und inkubieren in der Magnet für 15 Minuten
10. Vorsichtig dekantieren CD4 + Zellfraktion in einen markierten 15 mL Röhrchen durch Umdrehen des Magneten und Entleeren alle, aber die letzten Tropfen
11. Fügen Sie ein weiteres 2 ml Laufpuffer bis zur 5 ml Tube und entfernen Sie aus Magneten
12. Vorsichtig spülen Sie die CD4-Zellen aus den Seiten der Röhre und den Transfer zu einem deutlichen 15 ml Röhrchen
13. Add 2 mL T-Zell-Medium in jedes Röhrchen, entfernen Aliquots zur Zellzählung und Zentrifuge bei 230 × g für 10 Minuten.
14. Verdünnen Zellaliquote mit Trypanblau und zählen mit einer Zählkammer. Diese Zellzahl bestimmen die Anzahl der Bohrlöcher für die Expansion Kultur Schritt verwendet.

2.11 - * Alternativ kann MACS Säulen und Kugeln (Miltenyi Biotec), die AutoMACS Zellseparator (Miltenyi Biotec), oder Robosep Zellseparator (Stem Cell Technologies) gemäß produziert Anweisungen anstelle der Schritte 2.2 verwendet werden.

3. In-vitro-Expansion Kultur

1. Absaugen von Flüssigkeit aus der CD4 + und CD4-Zell-Pellets und auf der Zellzahlen auf, fügen Kulturmedien (in der Regel 3 Millionen CD4 +-Zellen pro mL und 10 Millionen CD4-Zellen pro mL funktioniert gut für die Einrichtung der Kultur). Der Ausbau Kultur erfordert 3 bis 5.000.000 CD4-Zellen pro Vertiefung und 2 bis 3.000.000 CD4 +-Zellen pro Well in einem Gesamtvolumen von 1 mL Kulturmedium in einer 48-well-Kulturplatte. Typischerweise sind CD4 + Zellen die Begrenzung Bevölkerung
2. Wenn gewünscht, bestrahlen die CD4-Zellen (5000 Rad s). Aliquot CD4-Zellen in die entsprechende Anzahl von Brunnen auf einem 48-Well-Platte, indem 300-500 ul jeder. Die Platte wird in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde. Die adhärenten CD4-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen in den Ausbau Kultur dienen.
3. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator.
4. Vertiefungen durch Zugabe von 500 uL der frischen Medien und sanft und Abpipettieren 12-20 mal mit einem Transfer-Pipette und Entfernen aller der Flüssigkeit. Dieser Waschvorgang wird hinter einer Schicht aus anhaftenden Antigen-präsentierenden Zellen zu verlassen.
5. Wenn die Wäsche fertig ist, fügen gerade genug Medien zum Boden jeder Vertiefung (etwa 100 uL) nass - sonst die anhaftenden Zellen austrocknen
6. Add 2 bis 3.000.000 CD4 +-Zellen in jedes Well. Wenn nötig, fügen Sie zusätzliche Medien auf das Gesamtvolumen in jede Vertiefung bis zu 1 mL zu bringen.
7. Fügen Sie die gewünschten Peptids in jede Vertiefung. Die typische Konzentration für die Stimulation von 10 ug / mL endgültig.
8. Legen Sie Platte in einem 37 ° C Inkubator für 7 Tage.
9. Nach 7 Tagen werden 50 ul Hemogen IL-2 (oder gleichwertig, wie rekombinante IL-2, 10 IU / mL) in jede Vertiefung.
10. Auf jeden weiteren Tag, Monitor Zellwachstum unter dem Mikroskop. Feed Brunnen, die noch nicht konfluent, indem die Hälfte der Medien, Zugabe von frischem Medium und 50 uL von IL-2. Split konfluenten Vertiefungen durch Resuspendieren der Zellen, bewegte die Hälfte der Zellen zu einem leeren Brunnen, Zugabe von frischem Medium und 50 uL von IL-2. Zurück Zellen-Inkubator.
11. Die expandierende Zellen werden bereit sein für das Tetramer nach 13-15 Tagen der Kultur.

4. Visualizing T-Zellen durch Tetramer-Färbung

1. Kauf oder montieren Tetramere an das Peptid / MHC-Kombinationen, die stimulierten CD4 + T-Zellen (siehe Diskussion zum Quellen der Tetramer-Reagenzien) übereinstimmen übereinstimmen. Tetramere sollte ~ 0,5 mg / ml Lösung sein.
2. Entfernen Platte aus Inkubator
3. Vorsichtig abziehen Hälfte der Medien aus jedem Well
4. Eine kleine Menge von Zellen aus jedem Well - typischerweise 75 &mgr; l oder ca. 50.000 Zellen - in eine 5 ml Polystyrol FACS-Röhrchen
5. Add Tetramer - in der Regel 1 ul pro 50 ul Gesamtvolumen - und in 37 ° C Inkubator für 1-2 Stunden. Es ist auch ratsam, eine zweite Teilmenge von Zellen aus jedem Well Fleck mit einer unpassenden Tetramer als negative Kontrolle.
6. Label-Zellen mit anti-CD3, anti-CD4 und anti-CD25 Antikörper, die durch Zugabe von 3-10 ul jedes Antikörpers. Zusätzliche oder alternative Antikörper Marker verwendet werden kann. Jedoch nicht verwenden PE-markierten Antikörpern, da dieser Kanal für die Tetramere reserviert werden muss. Zu dieser Zeit, auch Label einfarbig oder Isotypkontrollen mit zusätzlichen Zellen.
7. Inkubieren Antikörper markierten Zellen für 15-30 Minuten auf Eis oder bei 4 ° C.
8. Wash jedes Röhrchen mit 0,5 bis 2 ml Laufpuffer und Zentrifuge bei 230 × g für 10 Minuten.
9. Dekantieren Sie vorsichtig Flüssigkeit aus FACS-Röhrchen. Speichern Sie alle Rohre in einem abgedeckten Behälter (vorzugsweise auf Eis) für die anschließende FACS-Analyse.

5. Durchflusszytometer Datenerfassung und-analyse

1. Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer mit Verweis Perlen.
2. Stellen Sie sicher, Geräteeinstellungen:
   1. Mit ungefärbten Kontrolle Zellen oder Isotypkontrollen, passen Sie den Pfad der lebensfähigen Lymphozyten-Gate (FSC vs SSC). Entfernen Autofluoreszenz von allen Kanälen durch Zentrieren der Bevölkerung (durch Änderung der Gain-Einstellungen) unter den ersten zehn Jahren auf jeder Achse.
   2. Mit einfarbige Röhren, in der Mitte Ereignisse im richtigen Quadranten für jede einzelne Farbe (durch Änderung der Vergütung Einstellungen).
   3. Führen Sie eine Feinabstimmung der Geräteeinstellungen über einen Schlauch mit einem irrelevanten Tetramer gefärbt. Insbesondere die Einstellungen für die PE-Kanal muss möglicherweise angepasst werden, weil Tetramere oft Flecken heller als der Antikörper zu kontrollieren. Die irrelevant Tetramer sollte Fleck <0,5% der CD4 +-Zellen.
3. Erfassung von Daten für jede Röhre
   1. Sammeln Sie Veranstaltungen für jeden Probenröhrchen und negative Kontrolle Rohr
   2. Erfassen und Speichern mindestens 20.000 Veranstaltungen für Analysys
4. Analysieren von Daten
   1. Import von Daten-Dateien in FACS-Analyse-Software (zB CellQuest Software, WinMDI oder FlowJo). Starten Sie Ihre Analyse mit einem Rohr gebeizt mit einem irrelevanten Tetramer.
   2. Plot FSC vs SSC und zeichnen Sie einen Schutzzaun um den Live-Lymphozyten (Abbildung 1, oben links).
   3. Plot CD4 vs CD3 (gated zu leben Lymphozyten nur Show) und ziehen Toren rund um die CD3 + und CD4 +-Populationen (Abbildung 1 oben rechts).
   4. Plot CD4 vs Tetramer (gated auf CD3 + Lymphozyten nur Show) und stellen Sie die Quadrantengrenzen so, dass die CD4 + Tetramer + Bevölkerung ist weniger als 0,5% (Abbildung 1 unten links).
   5. Plot CD25 vs Tetramer (gated an CD4 +-Lymphozyten nur Show) und stellen Sie die Quadrantengrenzen, so dass die CD25 + + Tetramer Bevölkerung weniger als 0,5% (Abbildung 1 unten rechts) ist.
   6. Analysieren Sie alle Probenröhrchen ohne die Tore.

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Abbildung 1. Representative negative Kontrolle Tetramer Färbung Ergebnisse. Die linke obere Feld zeigt Vorwärtsstreuung Verse side scatter und die Lymphozyten-size-Gate (R1). Der obere rechte Fenster ist geschlossen für R1 und zeigt ant-CD4 oder anti-CD3 und CD3 + (R2) und CD4 + (R3) Toren. Die linke untere Panel ist geschlossen für R2 und zeigt anti-CD4 gegenüber Tetramer. Das untere rechte Fenster ist geschlossen für R3 und zeigt anti-CD25 gegenüber Tetramer. Die Quadranten sowohl für Tetramer Parzellen wurden auf 0,5% festgelegt.

6. Repräsentative Ergebnisse

1. Das Tetramer-positiven Zellen sollte eine deutliche Bevölkerung unter den erweiterten CD4 +-Zellen (Abbildung 2).
2. Tetramer-positiven Zellen sind in der Regel CD25 + CD4 und oft hoch.
3. In einigen Fällen kann ein MHC / Peptid-Kombination geben Hintergrundfärbung (oft durch ein Peptid mit schlechten Löslichkeit verursacht). Solche Hintergrundfärbung kann von einem echten positive differenziert werden, da die "false positive" Zellen nicht eine einzige deutliche Bevölkerung entweder auf der CD4 vs Tetramer oder CD25 vs Tetramer Plots (Abbildung 3).

Abbildung 2. Representative positive Tetramer Färbung Ergebnisse. Die Panel-Layout und Gating-Strategie sind identisch mit 1 Abbildung. Das Tetramer-positiven Zellen erscheinen als eigenständige CD4 hohe Bevölkerungsdichte auf dem anti-CD4 gegenüber Tetramer-Panel und eine deutliche CD25 + Population auf dem anti-CD25 gegenüber Tetramer-Panel.

Abbildung 3. Representative "false positive" Tetramer Färbung Ergebnisse. Die Panel-Layout und Gating-Strategie sind identisch mit 1 Abbildung. Die anti-CD4 gegenüber Tetramer-Panel zeigt eine undeutliche "mounded" Färbung. Die anti-CD25 gegenüber Tetramer zeigt auch eine "mounded"-Färbung, ohne klaren Trend in Richtung zu CD25 +.

Diskussion

Verständnis der Rolle der CD4 + T-Zellen im Immunsystem ist von grundlegender Bedeutung. Allerdings können Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen schwer zu erkennen und zu isolieren, die mit traditionellen Methoden. Im Gegensatz dazu erlauben MHC-Klasse-II-Tetramere die direkte Visualisierung von CD4 + T-Zellen mit der gewünschten Antigen-Spezifität. Dieses Video zeigt die Isolierung, Reinigung und In-vitro-Amplifikation von CD4 + T-Zellen und deren anschließende Visualisierung mit Tetrameren. Klasse II Tetramere sind fluo...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Klasse-2-Laminarströmungs-Biosicherheitsschrank	Ausrüstung	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	Oder äquivalent
50 mL konisches Rohr	Ausrüstung	VWR international	47747-182	Oder äquivalent
1x PBS (ca/mg frei)	Reagenz	Hyclone	SH30028.02	Oder äquivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagenz	GE Healthcare	17-1440-03	Folie umwickelt, um vor Licht zu schützen
Pipet Aid XP	Ausrüstung	Drummond Scientific	4-000-101	Oder äquivalent
10-mL-Pipette	Ausrüstung	Corning	CLS4492	Oder äquivalent
Aerosolbehälter	Ausrüstung	Beckman Coulter Inc.	359481	mit 50-mL-Einsätzen
Zentrifuge	Ausrüstung	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	Oder äquivalent
Transferpipetten	Ausrüstung	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202–20ER	Oder äquivalent
Pasteur-Pipeten	Ausrüstung	VWR international	14672-200	Oder äquivalent
Hämolytischer Puffer	Reagenz	N/A	N/A	8,3 g/L NH4Cl, 1,0 g/L NaHCO3, 0,04 g/L Dinatrium EDTA
Trypan blau	Reagenz	Sigma-Aldrich	T6146	0,2 % in PBS
Hämozytometer	Ausrüstung	VWR international	15170-208
15 mL konische Röhre	Ausrüstung	VWR international	05-527-90	Oder äquivalent
Laufender Puffer	Reagenz	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Zell-Isolationsset II	Reagenz	Miltenyi Biotec	130-091-155	Oder äquivalent
EasySep® Magnet	Ausrüstung	Stammzelltechnologien	18000
5-mL Polypropylenrohr	Ausrüstung	Falcon BD	352063
RPMI 1640	Reagenz	Invitrogen	22400-089	mit 25 mM HEPES
Gepooltes menschliches Serum	Reagenz	N/A	N/A	von gesunden Spendern entnommen, Wärme inaktiviert und gefiltert
Pen Strep	Reagenz	Invitrogen	1570-063	Oder äquivalent
500mL 0,22 Mikron Flaschendeckelfilter	Ausrüstung	Nalge Nunc Nationalspielerin	595-3320	Oder äquivalent
48-Bohrloch-Platte	Ausrüstung	Costar	3548	Oder äquivalent
37° C CO2 Inkubator	Ausrüstung	Sanyo	MCO-18AIC	Oder äquivalent
20 mg/mL synthetisches Peptid	Reagenz	N/A	N/A	Individuelle Synthese von jedem Peptidanbieter
5-mL FACS-Röhre	Ausrüstung	Falcon BD	352008	Styropor
Peptidgeladenes Klasse-II-Tetramer (wie beschrieben)	Reagenz	N/A	N/A	Vorbereitet vom BRI-Tetramerkern
Anti-CD3	Reagenz	BD Biosciences	347344	Oder äquivalent
Anti-CD4	Reagenz	eBioscience	17-0049-73	Oder äquivalent
Anti-CD25	Reagenz	eBioscience	11-0259-73	Oder äquivalent
Facs Calibur Durchflusszytometer	Ausrüstung	BD Biosciences	342975	Oder äquivalent