Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zum Gehirn Proteine, die auf die volle Länge C-Terminus von ATP-gated P2X2-Rezeptoren binden zu identifizieren. Der Ausbau und die systematische Anwendung dieses Ansatzes auf alle P2X-Rezeptoren wird voraussichtlich zu einem besseren Verständnis der P2X-Rezeptor Signalgebung führen.
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Methodenartikel
Proteomics, um Proteine interagieren mit P2X2 Ligand-Gated Kationenkanäle Identifizieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Liganden-gesteuerte Ionenkanäle unterliegen synaptischen Kommunikation im Nervensystem 1. Bei Säugetieren gibt es drei Familien von Liganden-gesteuerte Kanäle: die Cys-Schleife, die Glutamat-gesteuerten und der P2X-Rezeptor-Kanäle 2. In jedem Fall bindend des Senders führt zur Öffnung einer Pore, durch die Ionen fließen ihres elektrochemischen Gradienten. Viele Liganden-gesteuerte Kanäle sind auch durchlässig für Kalzium-Ionen 3, 4, die stromabwärts Signalisierung haben Rollen 5 (zB Gen-Regulation), dass die Dauer der Kanalöffnung überschreiten darf. So Liganden-gesteuerte Kanäle können über weite Zeitskalen von wenigen Millisekunden bis Tagen Signal. Angesichts dieser wichtigen Rolle ist es notwendig zu verstehen, wie Liganden-gesteuerte Ionenkanäle sich durch Proteine reguliert werden, und wie diese Proteine können tune-Signalisierung. Neuere Studien legen nahe, dass viele, wenn nicht alle Kanäle kann ein Teil des Proteins Signalkomplexe 6 sein. In diesem Artikel erklären wir, wie die Proteine, die an der C-terminalen Aspekte des P2X2-Rezeptors cytosolischen Domäne binden zu identifizieren.
P2X-Rezeptoren sind ATP-gated Kationen-Kanäle und bestehen aus sieben Untereinheiten (P2X1-P2X7). P2X-Rezeptoren sind weit verbreitet im Gehirn, wo sie vermitteln exzitatorischen synaptischen Transmission und präsynaptischen Erleichterung der Neurotransmitter Release 7 zum Ausdruck gebracht. P2X-Rezeptoren sind in erregbaren und nicht-erregbaren Zellen gefunden und vermitteln wichtige Rollen in neuronalen Signalübertragung, Entzündungen und Herz-Kreislauf-Funktion 8. P2X2-Rezeptoren sind reichlich im Nervensystem 9 und stehen im Mittelpunkt dieser Studie. Jeder P2X-Untereinheit wird angenommen, dass zwei Membran überspannt Segmente (TM1 und TM2) durch einen extrazellulären Bereich 7 und intrazelluläre N-und C-Terminus (Abb. 1a) 7 getrennt zu besitzen. P2X-Untereinheiten 10 (P2X1-P2X7) zeigen 30-50% Sequenzhomologie auf Aminosäure-Ebene 11. P2X-Rezeptoren enthalten nur drei Untereinheiten, die den einfachsten Stöchiometrie unter ionotropen Rezeptoren ist. Der P2X2-C-Terminus besteht aus 120 Aminosäuren (Abb. 1b) und enthält mehrere Protein-Docking-Konsens Standorten unterstützen die Hypothese, dass P2X2-Rezeptors kann Teil Signalkomplexe werden. Doch obwohl mehrere Funktionen, die C-Terminus von P2X2-Rezeptoren 9 zugeschrieben haben keine Studie hat die molekulare Partner beschrieben, dass einige der intrazellulären Seite des Proteins über die volle Länge C-Terminus. In diesem Verfahren Papier beschreiben wir eine Proteom-Ansatz, um die Proteine, die mit der vollen Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren interagieren zu identifizieren.
Protokoll
Experimentelle Verfahren
Das experimentelle Verfahren (Abb. 2) besteht aus vier Teilen, die in einer stufenweisen Weise beschrieben werden.
Teil 1: Subklonierung und Expression der C-Terminus von P2X2-Rezeptoren.
Wir haben die volle Länge C-Terminus von P2X2-Rezeptoren in Bakterien auf das Gehirn Proteine, an die es bindet identifizieren ausgedrückt.
- Der C-Terminus (Aminosäuren 353-472) des P2X2-Rezeptors (Abb. 1) wurde durch PCR amplifiziert, kloniert in pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) und verifiziert mit Sequenzierung.
- Das rekombinante Plasmid wurde in E.....
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Diskussion
Ionenkanäle sind eine wichtige Klasse von integralen Membranproteinen. Sie enthalten Wasser gefüllten Poren, die selektiv erlauben die Bewegung der Ionen bis ihre elektrochemischen Gradienten über die Plasmamembran. Ionenkanäle Tor zwischen offenen und geschlossenen Zuständen. Die Gating Schritt wird durch Sender (z. B. ATP) im Falle von P2X-Liganden gesteuerte Ionenkanäle ausgelöst, oder es kann durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen reguliert werden. Das letzte Jahrzehnt hat eine Erhöhung der unser Verständnis, .......
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Danksagungen
SW und TMV werden durch die NCRR und NHLBI an den National Institutes of Health unterstützt. BSK und HS werden von der NINDS und NIGMS der National Institutes of Health unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |
|---|---|---|---|---|
| Acetonitril | Reagenz | JT Baker | 9829-02 | |
| Acrylamid | Reagenz | Bio-Rad | 161-0156 | |
| Ampicillin | Reagenz | VWR international | VW1507-01 | |
| Ammoniumhydrogencarbonat | Reagenz | Fluka | 09830 | |
| Ammoniumpersulfat (APS) | Reagenz | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Adenosintriphosphat (ATP) | Reagenz | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Bradford-Reagenz | Reagenz | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Bromphenolblau | Reagenz | Fisher Scientific | B-392 | |
| Commassie-Blau R-250 | Reagenz | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| Dithiotreitol (DTT) | Reagenz | EMD Millipore | 3860 | |
| Ethylenediamintetraessigsäure (EDTA) | Reagenz | VWR international | VW1474-01 | |
| Ethylenglycol-bis(β-Aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraessigsäure (EGTA) | Reagenz | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Ameisensäure | Reagenz | EMD Millipore | 11670-1 | |
| Glutathion-Sepharose-4B-Kügelchen | Reagenz | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| Salzsäure (HCl) | Reagenz | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Reagenz | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| Iodoacetamid | Reagenz | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Luria-Bertani (LB)-Medium | Reagenz | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| Leupeptin | Reagenz | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Lysozym | Reagenz | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Magnesiumsulfat (MgSO₄)4) | Reagenz | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Natriumchlorid (NaCl) | Reagenz | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Natriumfluorid (NaF) | Reagenz | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| Natriumorthovanadat (Na3VO4) | Reagenz | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Nonidet P40 | Reagenz | Fluka | 74385 | |
| Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) | Reagenz | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease-Inhibitortablette | Reagenz | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Proteinstandard | Reagenz | Bio-Rad | 161-0305 | |
| Sarkosyl | Reagenz | Acros Organics | 61207 | |
| Verschlussfläschchen mit Schraubverschluss | Werkzeug | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| Natriumdodecylsulfat | Reagenz | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® Rubyprotein-Geleinfärbung | Reagenz | Bio-Rad | 170-3125 | |
| N,N,N’,’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Reagenz | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris-Basis | Reagenz | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Reagenz | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Trypsin | Reagenz | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | Reagenz | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| Wasser | Reagenz | Burdick && Jackson | 365-4 | |
| LTQ-Orbitrap-Tandem-Massenspektrometer | Werkzeug | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| System der Nano-Flüssigkeitschromatographie | Werkzeug | Eksigent | ||
| B-Mercapto–Ethanol | Reagenz | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Glycerin | EMD Millipore | GX0185-6 |
Referenzen
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
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Nachdrucke und Genehmigungen
