Methodenartikel

ES-Zellen abgeleiteten neuroepithelialen Zellkulturen

DOI:

10.3791/118

⸱

30. November 2006

 ,  ,  , 
1McLean Hospital, Harvard Medical School

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ableitung von neuro-Vorläufer aus embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) mit Stroma-Zellen abgeleiteten induzierende Aktivität (SDIA).

Zusammenfassung

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ES-Zellen haben das Potenzial, in die Zellen aus aller Keimblätter, die sie zu einem attraktiven Werkzeug für die Entwicklung neuer Therapien ist zu differenzieren. In der Regel folgt die Differenzierung von ES-Zellen das Konzept zum ersten generieren unreifen Vorläuferzellen, die dann vermehrt und differenziert zu reifen zellulären Phänotypen können. Dies gilt auch für ES-Zellen abgeleiteten Neurogenese, in denen die Entwicklung von neuralen Zellen folgt zwei wichtige Schritte: Erstens, die Gewinnung und Erweiterung von unreifen Vorstufen neuroepithelial und zweitens, deren Differenzierung zu reifen Nervenzellen. Eine gängige Methode, um neuronale Vorläuferzellen aus ES-Zellen produzieren auf Embryoidkörper (EB)-Bildung, die die Differenzierung von Zellen aus aller Keimblätter einschließlich Neuroektoderms verrät basiert. Eine alternative und effizientere Methode, um neuro-Zell-Entwicklung zu induzieren verwendet Stroma-Zellen abgeleiteten induzierende Aktivität (SDIA), die durch Co-Kultivierung ES-Zellen mit Totenkopf aus Knochenmark stammende Stromazellen (1) erreicht werden kann. Beide, EB Bildung und SDIA zeigen die Entwicklung der Rosette-ähnliche Strukturen, die vermutlich neuronale ähneln Rohr-und / oder Neuralleiste-like Vorfahren. Die neuralen Vorläuferzellen isoliert werden ausgebaut und weiter differenziert in bestimmten Neuronen und Gliazellen mit definierten Kulturbedingungen. Hier beschreiben wir die Erzeugung und Isolierung solcher Rosetten in Co-Kultur Experimente mit der stromalen Zelllinie MS5 (2-5).

Protokoll

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Schritt 1

  1. Platte Mitomycin-C ggrowth-gehemmt (10 ug / ml für 2,5 Stunden) MS5 Zellen mit einer Dichte von 70.000 / cm2 auf Gelatine-beschichteten (0,01% für 30 Minuten) 6-Well-Platten in α-MEM-Medien.
  2. Wenn die Zellen verbunden sind und bildeten eine Monoschicht (über Nacht Wachstum), wechseln Sie in SRM.
  3. Manuell zu isolieren ES Zellkolonien aus der ES-Zellkulturen mit Hilfe einer Spritze mit einer 27 ½ G Nadel.
  4. Tritrurate den Kolonien vorsichtig mit einem 1 ml blaue Spitze und Platte bei geringer Dichte auf der MS5 Zellen (in der Regel 2-3 Kolonien pro 6-Well-Platte).

Hinweis: Die ES-Zellen können auch aus der enzymatischen Vermehrung mittels Collagenase oder Trypsin genommen werden.

Schritt 2

  1. Wachsen die ES-Zellen auf der MS5 Feeder für 14-21 Tage, bis Rosette-haltigen Kolonien zu bilden.


Hinweis: Ändern Medien oft. Die Rosetten sind in der Regel an den äußeren Rändern der Kolonien und ihre Bildung deutlich verbessert werden kann, wenn 300-500 ng / ml Noggin dem SRM (3) hinzugefügt wird. In einigen Differenzierung Protokollen kann SRM mit N2-A Media ausgetauscht und ergänzt werden mit dem Wachstum oder andere Faktoren zu Zelle Spezifikation (2-5) zu fördern.

Schritt 3

  1. Isolieren und wählen Sie die Rosetten mit einem 27 ½ G Nadel unter dem Mikroskop.

Hinweis: Vermeiden Sie Schnitte und Kommissionierung der MS5 Stromazellen. Wenn Kolonien mit Rosetten sind gepackt, kann man auch die Isolierung der gesamten Kolonie.


Schritt 4

  1. Saugen Sie das Cluster von Rosetten, tritrurate sie sorgfältig mit einer 1 ml blaue Spitze und Platte sie auf Poly-L-Ornithin (0,001%) und Fibronektin (1 pg / ml) oder Laminin (1 pg / ml)-beschichteten 6 Vertiefungen in N2-A Media in der Regel mit bFGF (20 ng / ml) ergänzt. Die Rosetten wird die Reform und Erweiterung.

Hinweis: Um das Überleben der Zelle zu verbessern, kann eine Platte der kleinen Clustern in Tröpfchen zu erhöhen Zelldichte. Dieser Schritt kann auch durch Ergänzung der N2-A-Medien mit zusätzlichem Wachstum oder andere Faktoren zu Zelle Spezifikation (2-5) zu fördern geändert werden.

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Diskussion

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Dieses Protokoll zeigt die verschiedenen Schritte bei der Erzeugung und Isolierung Neuroepithelzellen aus menschlichen ES-Zellen mit SDIA. Die Anwendung dieser Methode ist vielfältig und hat in vielen Protokollen verwendet worden, um bestimmten Nervenzellen zu produzieren (z. B. 1, 2, 5-9). Die Rosetten sind gedacht, um Neuralrohrdefekte Zellen mit einer vorderen Phänotyp (2, 5, 10) ähnlich und enthalten auch Neuralleiste Vorläuferzellen (11, 12). Darüber hinaus behalten sie ein gewisses Maß an Plastizität, da sie durch spezifische Faktoren...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
L-GlutaminGIBCO, by Life Technologies25030
alpha-MEMGIBCO, by Life Technologies12571
Penicillin/StreptomycinGIBCO, by Life Technologies15140
Knockout-DMEMGIBCO, by Life Technologies10829
Knockout-SerumersatzGIBCO, by Life Technologies10828
MEM nichtessentielle AminosäurelösungGIBCO, by Life Technologies12383
DMEM/F12GIBCO, by Life Technologies11330
N2-A-ZusatzStem Cell Technologies07152
Mitomycin-CSigma-AldrichM0503
Gelatine Typ-ASigma-AldrichG1890
Poly-L-OrnithinSigma-AldrichP49570,01%-ige Lösung
LamininSigma-AldrichL-2020
FibronectinSigma-AldrichF2006
Grundlegender Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF)Invitrogen13256
1-mL-Spritze mit 27½-G-NadelBD Biosciences309623
N2-A-MediumMediumDMEM/F12 + 1 % N2-A-Zusatz
Serumersatzmedium (SRM)MediumKnockout-DMEM + 20 % Knockout-Serumersatz + 1 % MEM nichtessentielle Aminosäurelösung + 2 mM L-Glutamin
α-MEM-MediumMediumα-MEM + 10 % FBS + 2 mM L-Glutamin + 1 % Penicillin/Streptomycin
MS5ZelllinieStromazellen
Mikroskop
6-Loch-Plattenfür Zellkultur

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  2. Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
  3. Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
  4. Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
  5. Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
  6. Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
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Schlagwörter

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