Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

Summary

Die cDNA-Microarray PtGen2 war für die Genexpression Studien in loblolly Kiefer entwickelt, P. taeda Und andere Nadelbaumarten. Hier zeigen wir Pre-und Post-Hybridisierung Bearbeitung und Reinigung Techniken, die mit diesem Array verwendet werden, um eine bessere Konsistenz, verringert Artefakte und unteren Hintergründe liefern kann.

Abstract

PtGen2 ist ein 26.496-Funktion cDNA-Microarray mit verstärkten loblolly Kiefer ESTs. Das Array wird in unserem Labor für die Nutzung durch Forscher studieren die Genexpression in Kiefern und andere Nadelhölzer hergestellt. PtGen2 wurde als Ergebnis unserer Bemühungen zur Entdeckung von Genen in loblolly Kiefer entwickelt und wird von Sequenzen in erster Linie aus Wurzelgewebe identifiziert umfasst, sondern auch aus Nadel-und Stammzellen. ^1,2 PtGen2 durch Kreuzungen verschiedener Cy-Farbstoff markiert Nadelbaum Ziel cDNAs wurde getestet , wobei sowohl verstärkt und nicht verstärkt indirekte Markierung Methoden und auch mit einer Reihe von Hybridisierung und Waschen Bedingungen getestet. Dieses Video konzentriert sich auf die Handhabung und Verarbeitung von Folien vor und nach dem Pre-Hybridisierung, sowie nach der Hybridisierung mit einigen Modifikationen der Verfahren entwickelt zuvor. ^3,4 Ebenfalls enthalten in Textform nur, sind die Protokolle für die Erzeugung, Kennzeichnung und Reinigung von Ziel-cDNA s, sowie Informationen über Software für Downstream-Verarbeitung verwendet.

PtGen2 ist mit einem proprietären Druckpuffer, dass hohe Konzentrationen von Salz, die nur schwer vollständig zu entfernen Dose enthält gedruckt. Die Folien werden zunächst in einem warmen SDS-Lösung vor pre-Hybridisierung gewaschen. Nach einer Vorauswahl Hybridisierung werden die Objektträger kräftig in mehrere Änderungen des Wasser gewaschen, um das Entfernen der restlichen Salze abzuschließen. LifterSlips ™ werden dann gereinigt und positioniert auf den Folien und markierte cDNA wird vorsichtig auf dem Mikroarray durch Kapillarwirkung, die für eine gleichmäßige Verteilung der Probe auf den Objektträger bietet geladen, und verringert die Chance von bubble Statuten. Hybridisierung von Zielen auf das Array wird bei 48 ° C bei hoher Luftfeuchtigkeit durchgeführt. Nach der Hybridisierung wird eine Reihe von Standard-Wäschen bei 53 ° C durchgeführt und Raumtemperatur für längere Zeit. Verarbeitung PtGen2 Dias mit dieser Technik reduziert Salz und SDS-derived Artefakte oft gesehen, wenn das Array weniger streng verarbeitet wird. Hybridisierende Ziele aus verschiedenen Koniferen RNA Quellen stammen, ergab diese Verarbeitung Protokoll weniger Artefakte, reduziert Hintergrund, und sofern eine bessere Konsistenz zwischen den verschiedenen experimentellen Gruppen von Arrays.

Protocol

(Hinweis Abschnitte 1 bis 4 nicht in Video demonstriert)

Vorbereitung Cy-markierten Target-cDNA

Was folgt, ist das Protokoll, die wir für die cDNA-Synthese aus loblolly Kiefer Gesamt-RNA und indirekten cDNA Kennzeichnung vor Hybridisierungen Microarray. Obwohl ein paar nicht-triviale Änderungen vorgenommen wurden, ist das Protokoll unter ähnlich wie in der Bedienungsanleitung SuperScript Indirekte die Invitrogen cDNA Labeling Kit zur Verfügung gestellt.

Teil 1: First-Strand cDNA Synthesis Reaction

1. Mix und kurz Spin jedes Kit-Komponenten vor der Verwendung.
2. Bereit....

Discussion

PtGen2 ist eine neu entwickelte, individuelle cDNA-Microarray, die entworfen, um in erster Linie durch die loblolly Kiefer Forschung verwendet werden sollte. Vorläufige Ergebnisse generiert bislang haben das Array gezeigt, dass ein wertvolles Hilfsmittel bei der Bewertung der Transkriptions-Ereignisse, die in Reaktion auf Trockenstress auftreten, sowie bei der Überwachung der Veränderungen, die während der Embryonalentwicklung entstehen in Pinien, Pinus pinaster ^5,6 Wir haben auch kürzlich gezeigt, d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			vor der Hybridisierung	: 5X SSC, 0,1 % SDS, 1 % BSA,
Hybridisierungspuffer	Puffer			30 % Formamid, 5x SSC, 5x Denhardt' s, 1% PolyA-RNA (Invitrogen, POLYA. GF), 0,1% SDS
Waschlösung #1	Puffer			1X SSC, 0,2% SDS, vorheizen auf 43° C
Waschlösung #2	Puffer			0,1X SSC, 0,2% SDS
Waschlösung #3	Puffer			0,1X SSC
Isopropylalkohol	Reagenz	Sigma-Aldrich	34959-2,5L 50mL
Konische Röhrchen	Sonstiges	Falcon BD	352070
15mL Konische Röhrchen	Sonstiges	Falcon BD	352196	Verwenden Sie diese oder eine ähnliche Kappe, die während der Zentrifugation am Boden jedes konischen 50-ml-Röhrchens platziert
. Coplin Jar		Wheaton	900520
Färbeschale & Gestell		Sonstiges Wheaton	900200
Albumin aus Rinderserum (BSA)	Sonstiges	Sigma-Aldrich	A-9418
PolyA RNA		Invitrogen	POLYA.
SuperScriptTM Indirektes cDNA-Markierungskit		Invitrogen	L1014-02
Turbo DNase	Kit	Ambion	AM1907
System
Cy-5	Farbstoffreagenz	GE Healthcare	PA25001
Cy-3	Farbstoffreagenz	GE Healthcare	PA23001
LifterSlips™	Weitere	Erie	Scientific 25X601
HybChambers	Geräte	GeneMachines	JHYB200003