Live-Imaging der Zebrafisch embryonalen Gehirn durch konfokale Mikroskopie

Zusammenfassung

In diesem Video zeigen wir eine Methode, mit der sich entwickelnden Gehirn Wirbeltiere in Live Zebrafischembryonen bei einzelnen Zelle Auflösung durch konfokale Mikroskopie zu analysieren. Dazu gehört auch die Methode, mit der wir spritzen die Single-Cell-Zebrafischembryo und anschließend montieren und Bild das sich entwickelnde Gehirn.

Zusammenfassung

In diesem Video zeigen wir die Methode unserem Labor entwickelt, um die Zellform Änderungen und Umstellungen erforderlich zu biegen und falten Sie die Entwicklung von Zebrafisch Gehirn (Gutzman et al, 2008) analysiert hat. Eine solche Analyse bietet ein neues Verständnis der zugrunde liegenden Zellbiologie für die Entwicklung der 3D-Struktur von Gehirn der Wirbeltiere erforderlich und erhöht unsere Fähigkeit, Neuralrohr Morphogenese zu studieren. Die embryonalen Zebrafisch Gehirn ist so geformt, Beginn 18 Stunden nach der Befruchtung (HPF) als die Ventrikel im Neuroepithel aufzublasen. Bis zum 24. hpf, sind die ersten Schritte von Neuralrohrdefekten Morphogenese abgeschlossen. Mit der hier beschriebenen Methode, werden Embryonen auf der einen Zell-Stadium mit mRNA Membran gezielte grün fluoreszierende Protein (memGFP) injiziert. Nach der Injektion und Inkubation des Embryos, die jetzt zwischen 18 und 24 HPF, montiert ist, invertiert, in Agarose und abgebildet durch konfokale Mikroskopie. Bemerkenswert ist, dass der Zebrafisch-Embryos transparent machen ihn zu einem idealen System für Fluoreszenz-Bildgebung. Während unsere Analysen auf das Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze und die Hinterhirn konzentriert haben, könnte diese Methode für die Analyse von jeder beliebigen Region der Zebrafisch zu einer Tiefe von 80-100 mu m verlängert werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der mRNA für die Injektion

1. Die mRNA in diesem Verfahren verwendet wird, aus einem Plasmid kodiert CAAX-eGFP (memGFP) mRNA transkribiert. Erste Linearisierung des Plasmids nach Gutzman et al, 2008.
2. Dann transkribieren memGFP mRNA mit der mMessage mMachine Kit.
3. Verdünnen Sie die resultierende mRNA zu 1μg/μl aliquotieren und bei -80 ° C.
4. Bereiten Sie ein Spritzgießwerkzeug von 1% Agarose mit Gassen der Breite des Embryos auf der einen Zell-Stadium.
5. Am Tag vor der Injektion, Einrichten Paarung Käfige trennen das Männchen vom Weibchen.
6. Am Tag der Injektion, ziehen Kapillare Nadeln mit einer Mikro....

Diskussion

In diesem Video zeigen wir eine Methode zur mRNA-Injektion in einzelne Zelle Zebrabärblinge. Hier verwenden wir mRNA eine Membran gezielte GFP zu jeder Zelle Label. Wir haben dann gezeigt, wie die Montage und Bild das sich entwickelnde Gehirn in einzelnen Zelle Auflösung. Diese Technik hat uns erlaubt, eine neue Art von Zelle Form zu ändern, basale Einschnürung, für die Bildung der Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze (Gutzman et al, 2008) erforderlich studieren. Ähnliche Analyse von anderen Phänomenen hat das Potenzial, deutli.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SeaKem GTG Agarose	Reagenz	Lonza Inc.	50027
3-Aminobenzoesäureethylester (Tricaine)	Reagenz	Sigma-Aldrich	A-5040
Kapillarrohre	Werkzeug	Frederick Haer und Co.	30-30-1	Borosil 1,0 mm Außendurchmesser × 0,5 mm Innendurchmesser/Faser 100 mm
Vakuumsilikonfett	Reagenz	VWR international	W0S717
Pinzette	Werkzeug	Fine Science Tools	11232-20	Dumont #5 Bio Inox
1–200 μl Pipettenspitzen	Werkzeug	USA Scientific, Inc.	111-0806	Diese haben die richtige Größe für 24 hpf-Embryonen.
mMessage mMachine Transkriptionskit	Reagenz	Ambion	AM1340	SP6-RNA-Polymerase
Zeiss LSM 510 Scanning-Konfokalmikroskop	Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.
Mikromanipulator	Werkzeug	Narishige International
Mikroinjektor	Werkzeug	Harvard Apparatus	PLI-100
Mikropipettenzieher	Werkzeug	Sutter Instrument Co.