Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

Zusammenfassung

In diesem Video zeigen wir, wie Label und visualisieren einzelne synaptische Vesikel Exozytose und Menschenhandel in Goldfische Netzhaut bipolaren Zellen mit insgesamt internen Reflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie.

Zusammenfassung

Insgesamt internen Reflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie ist eine Technik, dass die Studie die Geschehnisse an der Zellmembran ermöglicht, durch selektive Darstellung von fluoreszierenden Molekülen, die zu einem hohen Brechungsindex Substanz wie Glas am nächsten sind,

Protokoll

Teil 1: Dissection und Bipolar Zellisolation

1. Bereiten Sie Lösungen in Tabelle 2 aufgeführt; Der pH-Wert von Beringer "(extern)-Lösungen sollten mit NaOH auf 7,4 eingestellt und der pH-Wert der internen Lösung sollte auf 7,2 mit CsOH eingestellt werden. Schützen interne Lösung vor Licht mit Alufolie und halten Sie sie bei 4 ° C bis zur Verwendung;
2. Dark-Anpassung einen Goldfisch für mindestens 30 Minuten vor der Dissektion;
3. Während das Tier dunkel passt, bereiten 5 mL der Hyaluronidase (Typ V Hyaluronidase, 1100 Einheiten / ml in niedrigen Ca ^{2 +} Ringer; Sigma, St. Louis, MO) und 10 ml der L-Cystein (0,5 mg / mL in niedrigen Ca....

Diskussion

Die Vorteile der Ziel-Typ TIRF-Mikroskopie werden, dass 1) es hervorragende optische Schnitte bietet durch die Beschränkung Anregungslicht auf einen schmalen Bereich in der Brennebene des Objektivs und minimiert dadurch out-of-focus Licht, 2), da Licht fällt exponentiell mit der Entfernung kann eine Bewegung in vertikaler Richtung als eine Änderung in der Fluoreszenz-Intensität überwacht werden; 3) effiziente Lichtausbeute durch die hohe numerische Apertur Ziel ^1,5.

Der größte Nachteil dieser Technik ist, dass es zu bildg.......