Объединение периферического нерва Пересадка и Матрица модуляции Ремонт Травмированные Крыса спинного мозга

Summary

Травматические повреждения спинного мозга нарушается связь с мозгом. Чтобы восстановить утраченные связи мы используем периферических нервов трансплантата обеспечить субстрат для волокон регенерирующим в сочетании с нейротрофических факторов и матрица модуляции-ферменты, чтобы удалить тормозящий молекул способствовать росту долго расстояния.

Abstract

Травматические повреждения спинного мозга (ТСМ), вызывает гибель нейронов, нарушение двигательных и чувствительных нервных волокон (аксонов) путей и нарушение связи с мозгом. Одной из целей нашего исследования является содействие регенерации аксонов восстановить связь между поражением сайта. Для этого мы разработали периферических нервов (PN) прививка техники, где сегменты седалищного нерва, либо размещаются непосредственно между поврежденные концы спинного мозга или используются для формирования моста через поражения. Есть несколько преимуществ такого подхода по сравнению с трансплантацией других нервных тканей; регенерирующие аксоны могут быть направлены на достижение конкретной целевой области, количество и источник регенерации аксонов легко определяется путем отслеживания техники, трансплантат может быть использован для электрофизиологических экспериментов по измерению функционального восстановления связанной с аксонов в трансплантат, и это можно использовать аутологичных нерва, чтобы уменьшить вероятность отторжения трансплантата. В нашей лаборатории мы провели как аутологичных (донора и реципиента же животного) и гетерологичных (донора и реципиента различных животных) трансплантатов с сопоставимыми результатами. Этот подход успешно используется как в острой и хронической ситуации травмы. Регенерированный аксоны, которые достигают дистального конца трансплантата PN часто не распространяется обратно в спинной мозг, поэтому мы используем микроинъекции хондроитиназой деградировать тормозных молекулы, связанные с рубцовой ткани окружающие области ТСМ. В то же время мы обнаружили, что предоставление экзогенного роста и трофических молекул стимулирует большее расстояние аксонального отрастания в спинной мозг. Через несколько месяцев после трансплантации мы проводим разнообразные анатомические, поведенческие и электрофизиологические тесты для оценки восстановления функции в нашей спинного мозга раненых животных. Этот экспериментальный подход успешно применяется в нескольких моделях спинного травмы мозга, на разных уровнях травмы и у разных видов (мыши, крысы и кошки). Важно отметить, периферических нервов прививки подход эффективен в продвижении регенерации при острых и хронических поврежденных нейронов.

Protocol

1) Подготовка к микроскопической хирургии

1. Хирургических станция должна быть чистой и продезинфицировать с разбавленным раствором отбеливателя перед изложением инструментов и вспомогательных материалов. Инструменты будут автоклавного 1 день до операции и хранится в стерильный контейнер. Включите Горячие Стерилизатор бисера (Fine Инструменты наук) используется для удаления патогенных микроорганизмов и микробных загрязнений из инструментов между процедурами на различных животных.
2. Подключите тепловой барьер используется для поддержания температуры тела во время хирургического вмешательства. Изложить ватные тампоны и марлю колодки используются для остановки кровотечения. Подготовка малых (<2мм ³⁾ кусков пены гель для использования в микро-гемостаза и погрузиться в стерильный физиологический раствор.
3. Место крыс в камере индукции и анестезию с изофлюрана (5% испаряется в атмосфере кислорода, расход 2,0 л / мин). Удалить животных от камеры с подготовкой стола и бриться широкую область меха от предполагаемого операционного поля. Протрите 70% изопропиловый спирт начало в центре поля и излучающих наружу, а затем протереть Polyhydroxidine Решение (Xenodine) в том же порядке. Повторите эту последовательность моет 3 раза.
4. Место животное на тепловой барьер, накрыть нос и рот с вдыхании конус, уменьшить изофлюрана до 3% и расход до 0,2 л / мин. Доставить соответствующую дозу антибиотиков (ампициллин) путем подкожной инъекции и анальгетик (бупренорфин 0,05 мг / кг) внутримышечно.
5. Хирург скрабом руки с Xenodine раствор и ополосните водой. Хирургический стерильный халат будут установлены на хирурга, руки будут сушат стерильным полотенцем и покрывают стерильными перчатками. Эта процедура выполняется для каждой хирургической процедуры, описанные в этом тексте.
6. Крышка покрытие стерильные инструменты будут удалены помощником и инструменты будут выложены на стерильной покрытия хирурга.

2) Перерезка PN способствовать дегенерации

1. С животного лежа на боку сделать прямо разрез линии от головки бедренной кости к колену, держа параллельно и примерно 3 мм от бедра. Избавьтесь поверхностные мышцы бицепса бедра вдоль одной линии разрез кожи, вскрыть основные vastus латеральной мышцы.
2. Использование ножниц делают небольшой разрез в латеральной vastus возле колена и распространить это вверх, к голове бедренной кости. Опять же с ножницами аккуратно отделить vastus латеральной до соединенных большеберцового и малоберцового нерва ветвей седалищного нерва визуализируются (параллельно бедренной кости).
3. Трассировка этих отраслей в направлении головки бедренной кости до основного ствола седалищного нерва выявлено. Чуть ниже бифуркации седалищного нерва использования тонких щипцов тщательно отдельной соединительной ткани (эпиневрий), окружающих большеберцовой ветви нерва (это больше филиал).
4. После выделения скольжения 6-0 шелковые лигатуры вокруг большеберцового нерва и затянуть. Использование микро-ножницы для разреза нерва ростральнее вязью. Pass шов через мышцу vastus латеральной и галстук в узел. Это обеспечит линии для удобного расположения обрезанный конец большеберцового нерва, когда нерв должен быть собран 7-10 дней позже.
5. Вырождение большеберцового нерва до прививки обеспечивает среду, больше подходит для рост аксонов, чем свежие подготовки нерва.
6. Закрыть мышц vastus латеральной с 6-0 швов шелка. Закрыть двуглавой мышцы бедра с 6-0 швов шелка. Закрыть кожи с зажимами Мишель раны. Выключите поток изофлюрана, удалите конус вдыхания носом и поместить животное в клетке на проведение тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.

3) Удаление сегмента PN

1. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер.
2. Удалить раны клипов и отдельных предыдущего разреза кожи. Избавьтесь от шва поверхностных мышц подвергать vastus латеральной и прорезать шов в этой мышцы.
3. Трассировка шов, чтобы сократить конца большеберцовой нерва и удалить из шва нерва. Используйте тонкий пинцет, чтобы рассекать эпиневрий от 15 мм длина голени нерв и прорубить эту дистального конца. Удалить сегмент нерва и погрузиться в стерильных Хэнкс сбалансированный солевой раствор.
4. Если это гетерологичных эксперимент трансплантата эвтаназии животного при введении препарата в Euthasol. Если это аутологичных трансплантата эксперимент, ноги мышц и кожи закрыта, как описано в 2.6), подготовленных для животных шейки травмы спинного мозга, как описано ниже.

4) шейки травмы гемисекция и трансплантации

День 1

1. Анестезию животного, бриться и чистить интенсивностиДед операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер. Администрирование антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4).
2. Найдите затылочной выемку и видные T2 спинной позвоночного процесс и сделать надрез по всей длине между этими внешними ориентирами. Избавьтесь от средней линии поверхностных трапециевидной мышцы и отдельные основных шейных мышц ромбовидной. Держите мышцы друг от друга, вставляя спредера.
3. Глубокие супраспинальных мышцы должны быть вырезаны из спинной позвоночного процессов C4, C5 и C6. Использование rongeurs выполнять частичный ламинэктомии С5 разоблачить всю правую сторону и медиальной части левой части спинного мозга. Используйте видных спинной вены в качестве ориентира для средней линии спинной мозг.
4. Использование микро-лезвие скальпеля или 30 иглу, чтобы проколоть твердую мозговую оболочку и расширить разрез над C5 спинного мозга. Сделайте небольшой надрез в базовой субарахноидальное и мягкой мозговой оболочки.
5. С вытащил стекло микро-канюли для аспирации начинать спинного, правую сторону спинного мозга, используя мягкое давление и микро-щипцы для разделения тканей и облегчить его удаление. Продолжите через промежуточные и вентральной части спинного мозга, чтобы создать 2 мм в длину полости, что является полным от спины к брюху и от средней линии на боковых мозговых оболочек.
6. Место солевой пропитанный гелем пены в полость для достижения гемостаза.
7. Удалить сегмент периферического нерва из раствора Хэнкса. Аккуратно очистите эпиневрий от проксимальных 3 мм сегмента нерва и сопоставлять этой целью ростральной стенки полости поражения гемисекция. Безопасные сегмент с 10-0 шва через эпиневрий к твердой мозговой оболочке, то шов оболочки сомкнулись над имплантированным конце трансплантата.
8. Сэндвич трансплантат между 2 кусочка силиконовой мембраной (Biobrane) для защиты и легкой изоляции на более позднем этапе. Место рядом с С6, С7 и Т1 позвоночного процессов. Не сопоставлять дистального конца нерва спинного мозга или мышечной ткани.
9. Закрыть мышцы в слоях с 4-0 шва и закрыть разрез кожи с раной клипов.
10. Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.

День 21

11. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер и администрировать антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4). Избавьтесь поверхностные швы, чтобы разоблачить силиконовой мембраны, окружающей нерв трансплантата. Тщательно свободной длине нерва из силиконовой мембраны с использованием тонких щипцов и весной ножницы и отражаться от операционного поля.
12. Осуществить частичный ламинэктомии на правой стороне C7 позвоночного процесса. Пирс оболочек мозга, что и выше (4,4) и стремлением подготовить 1 мм ³ спинной полости поражения квадрант C7 спинного мозга. Используйте солевые пропитанный гелем пена для достижения гемостаза, а затем заменить гелем пены пропитанный хондроитиназой ABC. Лечить поражения сайта в течение 15 минут, обеспечивая свежий хондроитиназой пропитанный гелем пеной каждые 5 минут.
13. Обложка внешней длине нерва трансплантата с Silastic мембраны. Закрыть поверхностные мышцы 4-0 швов и разрез кожи с раной клипов. Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.

День 23

14. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер и администрировать антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4). Избавьтесь поверхностные швы, чтобы разоблачить силиконовой мембраны, окружающей нерв трансплантата. Не беспокоить трансплантата, а подвергать сайт C7 взяточничество и использование шприца Гамильтона с вытащил стеклянную канюлю microinject 1 мкл из хондроитиназой ABC в правую сторону спинного мозга примерно 1 мм дистальнее присоединением трансплантата в спинной мозг.
15. Аккуратно очистите эпиневрий от дистальной 2мм сегмента нерва и сопоставлять этой целью поражения полости C7. Безопасные сегмент с 10-0 шва через эпиневрий к твердой мозговой оболочки.
16. Закрыть поверхностные мышцы 4-0 швов и разрез кожи с раной клипов. Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.

5) Электрофизиологические записи потенциала действия у привитых и дистальных спинного мозга

1. Чтобы определить, электрическая активность передается через аксоны, которые переродились в PNG мы должны сначала выявить и изолировать трансплантата. Особое внимание должно быть принято во время этой процедуры, чтобы избежать физического повреждения трансплантата и это, когда использование Silastic мембраны после размещения трансплантата имеет важное значение. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место йэлектронной животное на тепловой барьер.
2. После открытия кожи и отделение поверхностных мышц, Silastic полос мембраны определить и тщательно расчлененный без взяток.
3. Использование rongeurs удалить спинной позвоночного процесс немедленно ростральной и каудально по отношению к PNG-сайтов спинного шнур присоединение. Будьте осторожны, чтобы не нарушить трансплантат слишком много в этот подход. Сделайте разрез в твердой мозговой оболочки на обоих уровнях.
4. Около 1 см ростральнее C5 трансплантат спинного сайт присоединение шнура вставить один провод (платина-иридий смеси) раздражающего электрода в спинной мозг ипсилатерального к поражению, на глубину около 1 мм. Аккуратно поднимите центральную часть трансплантата на биполярных подключен электрод. Обеспечить единый стимулирующих импульсов длительностью 10 мкА 100μsec и определить, если Есть потенциалов действия путешествия через аксоны, которые переродились в трансплантат.
5. Переключатель и размещения проводов, чтобы подключить электрод становится стимулирующим электродом и один провод вставляется в спинном мозге дистальнее присоединением PNG для спинного мозга и попытке записи потенциалов действия в спинном мозге.
6. В конце эксперимента обеспечивают поезда 1мА стимулы для продолжительности 100μsec при 50 Гц, в общей сложности на 1 час. Эвтаназии животных 1 час позже, заливать с 4% параформальдегида и обработки ткани спинного шнур для иммуноцитохимического обнаружения финансовых директоров в нейронах, которые были активированы регенерации аксонов в PNG.

6) Ретроградная маркировки нейронов, которые регенерации аксонов в PNG и антероградной маркировки регенерации аксонов, что обратно в спинной мозг

1. Для животных не проверено электрофизиологических меры можно определить источник аксоны, которые растут в взяточничество и ходе их окончания в спинном мозге. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер и разоблачить PNG, как описано в 6.1 выше.
2. Использование микро-ножницы, чтобы прорваться через трансплантат на середине пути и полосы обратно эпиневрий из разреза концов трансплантата. Отражение вырезать концы друг от друга и положить каждый на отдельном листе парафильмом.
3. Место тампон из геля пены пропитанный True Blue на проксимальном конце сократить на этикетке нейронов, которые способствовали аксону к PNG. Место тампон из геля пены пропитанные биотинилированного декстран амин (BDA) на дистальном конце сократить на этикетке аксоны, которые простираются от трансплантата обратно в спинной мозг.
4. Эвтаназии животных 3-4d позже, заливать с 4% параформальдегида и процесс головного и спинного мозга срезах тканей для флуоресцентной микроскопии для True Blue меченых нейронов или для BDA гистохимии для помеченных аксонов.

7) полное повреждение грудной перерезки и трансплантации

Это предлагает альтернативный подход к модели травмы шейки гемисекция выше. Здесь более серьезные, двусторонние травмы производится и сегментах периферического нерва помещаются в поражении полости, чтобы охватить и ростральной и хвостовой пни поврежденный спинной мозг.

День 1

1. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер. Администрирование антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4).
2. Определить T12 позвоночного уровня в точке вставки последнего ребра. Сделайте разрез кожи с этой точки ростральной более позвоночного процессов T11, T10 и T9. Избавьтесь от поверхностной фасции через супраспинальных мышц при этих трех процессов.
3. Выполнить полный ламинэктомии Т10 позвоночного процесс (вышележащих T12 сегмента позвоночника мозга). Использование микро-лезвие скальпеля или 30 иглу, чтобы проколоть мозговую оболочку и расширить разрез более Т12 спинного мозга. Сделайте небольшой надрез в базовой субарахноидальное и мягкой мозговой оболочки.
4. С вытащил стекло микро-канюли для аспирации начинать T12 спинного мозга двустороннем, используя мягкое давление и микро-щипцы для разделения тканей и облегчить его удаление. Продолжите через промежуточные и вентральной части спинного мозга для создания 3 мм длиной полости, что является полным спины к брюху, а также между боковыми мозговых оболочек.
5. Используйте солевые пропитанный гелем пена для достижения гемостаза, а затем заменить гелем пены пропитанный хондроитиназой ABC. Лечить поражения сайта в течение 15 минут, обеспечивая свежий хондроитиназой пропитанный гелем пеной каждые 5 минут.
6. Удалить сегмент периферического нерва из раствора с Хэнком. Аккуратно отражают эпиневрий от проксимальных 4мм сегмента нерва и сократить длину уютно соответствия между ростральной и хвостовой пни одну сторону спинного мозга. Место второй сегмент наряду с первым привитым сегменте, соединенный с другой стороны спинного мозга. Шовный оболочки закрыты более имплантированных графтов и крышка оболочки с небольшимкусок силиконовой оболочкой.
7. Закрыть мышцы в слоях с 4-0 шва и закрыть разрез кожи с раной клипов.
8. Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно.

День 3

9. Анестезию животного, бриться и чистить предназначен операционного поля, как описано выше (1,3). Место животное на тепловой барьер и администрировать антибиотики и анальгетики, что и выше (1,4). Избавьтесь поверхностные швы, чтобы разоблачить силиконовой мембраны вышележащих трансплантата сайта. Не беспокоить трансплантата, а подвергать спинного мозга каудально взяточничество и использование шприца Гамильтона с вытащил стеклянную канюлю microinject 1 мкл из хондроитиназой ABC в каждую сторону спинного мозга примерно 1 мм дистальнее присоединением трансплантата в спинной мозг.
10. Закрыть поверхностные мышцы 4-0 швов и разрез кожи с раной клипов. Место проведения животное в клетке на тепловой барьер и вернуться домой клетке, когда он будет начеку и активно. Выполните электрофизиологических стимуляции и записи и трассирующими маркировки, как описано в 5) и 6).

8) представитель Результаты

Когда эта процедура оптимизирована периферических нервов сегмент будет тесно интегрироваться с принимающей спинного мозга. Восходящие и нисходящие аксоны спинного войдет трансплантата, растут в относительно прямой линии, параллельной длина трансплантата и распространяется на дистальном конце трансплантата со скоростью примерно 1 мм в день. По достижении дистального конца, аксоны проникают смежных спинного мозга, если хондроитиназой была использована для удаления тормозных протеогликанов из окружающей рубцовой ткани. Функциональные связи будет определяться электрофизиологических и иммуноцитохимического обнаружения ответ нейронов спинного шнур к стимуляции аксонов в трансплантата. Анатомические корреляции для восстановления функций будет оцениваться путем отслеживания количества и длины аксонов, которые вышли за рамки нерва трансплантата обратно в спинной мозг.

Discussion

1. Для воспроизводимости эксперимента важно, чтобы уровень повреждения спинного мозга соответствует от животного к животному. Поэтому крайне важно, чтобы соответствующие позвоночного процесс ламинэктомии быть идентифицированы. Поскольку мы используем гемисекция или модели перерезки поражения в этом исследовании нет никакой двусмысленности о размере поражения или конкретных путей спинного были ранены или жалели.
2. Нужно, чтобы периферических нервов быть предварительно выродились до трансплантации, потому что это пищеварение инициирует периферических аксонов, чтобы обеспечить место для регенерирующих аксонов расти и потому, что он активирует Шванн клетки производят несколько нейротропных факторов, которые поддерживают врастание аксонов.
3. Первичное размещение вырезать концы трансплантата для спинного ткани шнур должен быть твердо (без повреждения трансплантата) для оптимизации роста аксонов в и из трансплантата. Прямое присоединение периферических нервов трансплантата для спинного мозга и обеспечение трансплантата швами имеет решающее значение.
4. Использование хондроитиназой для изменения внеклеточного матрикса вокруг трансплантата сайт другой важной особенностью этого эксперимента. Глиальные рубцовая ткань формируется в ответ на повреждение спинного мозга является структурной и химической барьер рост аксонов. Хондроитиназой переваривания тормозных содержание протеогликанов рубца способствует расширению аксонов в регенерирующих и за взяточничество.
5. Есть несколько областей для возможного изменения этой процедуры для улучшения степени рост аксонов в и из периферической трансплантата нерва. Мы экспериментировали с доставкой нейротрофических факторов на сайт аппозиции между взятками и хост спинного мозга содействовать регенеративной реакции ранения аксонов. Увеличение нейротрофических факторов может быть достигнуто путем инъекции вирусных векторов увеличения местного производства или в виде инъекций наночастиц для постепенного высвобождения факторов. Мы также рассматриваем Роль физических упражнений в содействии развитию производства эндогенных факторов нейротрофических чтобы облегчить рост аксонов. В дополнение к стремлению поражения моделей, описанных выше, мы разработали модель травмы шейки контузии и успешно применили наш подход периферических нервов трансплантата для поддержки аксонального регенерации.
6. Для всех наших исследованиях мы используем несколько анализов, чтобы измерить изменения в двигательных и чувствительных поведение после травмы спинного мозга и после прививки интраспинальной периферических нервов.

Значимость:

С периферических нервов прививки подход, описанный выше мы показали, что взрослые двигательные и чувствительные нейроны будут восстанавливать свои ранения аксонального процесса на большие расстояния, когда это предусмотрено соответствующим субстратом для роста. Мы показали, что этот подход может быть выполнен в виде острой или задержки стратегии лечения и что она может успешно применяться к малым (мыши, крысы) и большой (кошки) экспериментальных животных. Важно, что функциональная активность регенерирующие аксоны быть проверены и периферических нервов модель трансплантат обеспечивает сравнительно легкий доступ ко всем аксонов моста спинного мозга. Это очевидное преимущество по сравнению с другими подходами трансплантации.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-0 silk suture	ArosSurgical	T5A10N10
6-0 silk suture	McKesson	2693
Ampicillin	McKesson	483549
Antibody to cFos	Sigma-Aldrich	F7799
Biotinylated dextran Amine	Invitrogen	D7135
Buprenorphin (.3mg/ml)	McKesson	12496075701
Chondroitinase ABC	Associates of Cape Cod	100332-1A
Euthasol	Webster Veterinary	07-805-9296
Hanks Balanced Salt Solution	Cellgro	21-021-CV
Isoflurane	Henry Schein	209-1966
Michel Wound Clips	Fine Science Tools	12040-02
Neurotrace Kit	Invitrogen	N7167
True Blue	Sigma-Aldrich	T5891
Xenodine	Webster Veterinary	92201
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools
Forced Exercise Wheel	Lafayette Instruments
TreadScan System	Clever System
Infinite Horizon Impact Device	Precision Systems and Instrumentation
Magnetic Stimulation Device	Magstim