Wir beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von hohem Molekulargewicht von genomischer DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 um Sterivex Filter, durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung folgte konzentriert.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation
In diesem Artikel
Erratum-Hinweis
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Methode wird verwendet, um hochmolekulare genomische DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 &mgr; M Sterivex Filter, die mit Lagerung / Lysepuffer behandelt worden sind und archiviert werden bei -80 ° C konzentrierten Extrakt, und diese DNA mit einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten zu reinigen. Das Protokoll beginnt mit zwei einstündigen Inkubation Schritte, um DNA aus den Zellen zu befreien und zu entfernen RNA. Als nächstes wurde eine Reihe von Phenol: sind Chloroform und Chloroform-Extraktionen durch Zentrifugation durchgeführt, gefolgt von Proteinen und Zellmembran Komponenten, Sammlung der wässrigen DNA-Extrakt, und mehrere Puffer Austausch Schritte zu waschen und zu konzentrieren, den Extrakt zu entfernen. Fünfter Teil beschreibt die optionale Reinigung über Cäsiumchlorid-Dichtegradienten. Es wird empfohlen, mit weniger als 15 Proben auf einmal arbeiten, um Verwechslungen zu vermeiden und hieb-Protokoll Zeit. Die Gesamtzeit für dieses Protokoll benötigt wird, hängt von der Anzahl der Proben extrahiert werden. Für 10-15 Proben und unter der Annahme der richtigen Zentrifugation Ausrüstung zur Verfügung steht, sollte dieses gesamte Protokoll zu 3 Tage. Vergewissern Sie sich, die Hybridisierung Öfen gesetzt, um Temperatur zu Beginn des Prozesses.
Protokoll
Hinweis: Alle Reagenzien dieses Protokoll verwendet werden vom Labor Aktien in kleinere Arbeitsgruppen Aktien-das ist sehr wichtig, um eine Kreuzkontamination der DNA-Proben und Kontamination von Labor-Bestände zu vermeiden aliquotiert. Auch beim Pipettieren, stellen Sie sicher, Pipettenspitzen für jede zusätzlich um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, ändern.
Part One: Cell Lysis und Verdauung
- Beginnen Sie dieses Protokoll durch Auftauen der Sterivex Filtern, die zuvor konzentriert planktonischen Biomasse enthalten auf dem Eis. Der Einfachheit halber hier beschreiben wir das Verfahren für die Verarb....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Je nachdem, wie viele Proben verarbeitet werden sollen, kann dies eine zeitintensive Prozedur aufgrund der zwei einstündigen Inkubation Schritte, und die wiederholten Waschungen und Zentrifugationsschritte werden. Am besten ist es, zwei ganze Tage für dieses Verfahren zu planen, um genügend Zeit zu lassen. Wenn es Probleme gibt immer die endgültige Extrakt Volumen in der Amicon Rohr zu reduzieren bis zu 200-500μl während der DNA-Konzentration und Waschen, versuchen Sie zusätzliche TE Waschungen und Zentrifugationen (Wie.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Danksagungen
Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. JJW wurde durch Stipendien von NSERC und DAW unterstützt durch Stipendien von NSERC, Killam und die TULA Stiftung finanziert Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt. SL wurde von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1-cc-Spritze (26G5/8-Nadel) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1-ml-Spritze (26G5/8-Nadel) | BD Biosciences | 309597 | |
| 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen | Eppendorf | 0030 125.150 | |
| 15-ml-Röhrchen | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| 5-cc-Spritze | BD Biosciences | 309603 | |
| Amicon® Ultra-4 Zentrifugalfiltergeräte | EMD Millipore | UFC801096 | 10.000 nominale Molekulargewichts-Grenze |
| Butanol | Fisher Scientific | A383-1 | Mit Wasser gesättigt herstellen (Butanol:Wasser = 1:1) |
| Zentrifugenrotor, JA5.3 | Beckman Coulter Inc. | 368690 | |
| Zentrifuge, Avanti® J-E | Beckman Coulter Inc. | 369003 | |
| Cäsiumchlorid | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| Chloroform:IAA (24:1) | Sigma-Aldrich | 25666-500ML | |
| Äthidiumbromid (EtBr) | Sigma-Aldrich | E1510-10ml | |
| Natrium-EDTA-Dihydrat | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Hybridisierofen | Fisher Scientific | 13-247-10 | 37°C & 55°C |
| Lysispuffer | 0,75 M Saccharose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3) | ||
| Lysozym | Sigma-Aldrich | L6876-5G | 125 mg in 1000 μl TE |
| Microcon® Ultracel YM-30 Zentrifugalfiltereinheit | EMD Millipore | 42410 | 50-bp-Ausschuss |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) | Sigma-Aldrich | 77617-500ML | |
| Proteinase K | Qiagen | 19133 | |
| RNase A | Fisher Scientific | BP2539-100 | 10 μg/ml |
| Safe Imager™ Blaulicht-Durchlichtapparat | Invitrogen | S37102 | |
| Natriumlaurylsulfat (SDS) | Sigma-Aldrich | L4509 | 20 % SDS |
| Sterivex-Filter | Fisher Scientific | SVG010RS | |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tischzentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| TE-Puffer, pH 8,0 | |||
| Trizma® Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Zentrifugenrotor für Ultrazentrifuge, TLA 100 | Beckman Coulter Inc. | 343847 | |
| Ultrazentrifugenröhrchen (7×20 mm, PC) | Beckman Coulter Inc. | 343775 | |
| Ultrazentrifugenröhrchenhalter | Beckman Coulter Inc. | 348302 | |
| Ultrazentrifuge, Optima® Max | Beckman Coulter Inc. |
Referenzen
- Beja, O. To BAC or not to BAC: marine ecogenomics. Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).
- Beja, O., Suzuki, M. T. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ Microbiol
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation
Posted by JoVE Editors on 11/26/2014. Citeable Link.
A correction was made to "DNA Extraction from 0.22 µM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 ml RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 μl lysozyme (125 mg in 1000 μl TE) and 20 μl RNase A (10 μg/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37°C for 1 hour.
