Lentivirus Produktion

Zusammenfassung

Um Lentiviren, sind DNA-Vektoren in humanen 293-Zellen transfiziert. Nach der Ernte und die Konzentration der Überstand wird Virustiter mittels Fluoreszenz-Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Zusammenfassung

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein System von Gen-Silencing in lebenden Zellen. In RNAi, homologe Gene in der Reihenfolge auf short interfering RNAs (siRNA) sind in der post-transkriptionellen Staat zum Schweigen gebracht. Kurze Haarnadel-RNAs, Vorstufen von siRNA, kann mit Hilfe Lentivirus, so dass für RNAi in einer Vielzahl von Zelltypen werden. Lentiviren, wie das Human Immunodeficiency Virus, sind in der Lage zu infizieren sowohl teilende und nicht-teilenden Zellen. Wir beschreiben ein Verfahren, das zum Paket Lentiviren. Verpackung bezieht sich auf die Vorbereitung der zuständige Virus aus der DNA-Vektoren. Lentiviralen Vektor Produktion Systeme basieren auf einer 'split' System, wo die natürlichen viralen Genoms in einzelne Helfer Plasmid-Konstrukte wurde spaltet. Diese Aufspaltung der verschiedenen viralen Elementen in vier getrennten Vektoren vermindert die Gefahr der Schaffung von ein Replikations-fähig Virus durch zufällige Rekombination des lentiviralen Genoms. Hier sind ein Vektor, der die shRNA von Interesse und drei Verpackung Vektoren (p-VSVG, pRSV, pMDL) transient in humane 293-Zellen transfiziert. Nach mindestens einer 48-stündigen Inkubationszeit wird das Virus enthaltende Überstand geerntet und aufkonzentriert. Schließlich ist Virustiter von Reporter (fluoreszierend) Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.

Protokoll

Teil 1: Transfektion von HEK 293 Zellen zu Lentiviren Produce

* 24 Stunden vor der Transfektion Platte 2,5 x 10 ⁶ Zellen in eine 10 cm Schüssel für eine Konfluenz von 50-70% am nächsten Tag.

1. Starten Sie dieses Protokoll durch die Vorbereitung der DNA, mit denen man später transfizieren wird man die Zellen auf Viren zu machen. Zuerst verdünnten FuGENE 6 Transfektionsreagenz Roche, ein Lipid-Reagenz, dass Zellen nehmen DNA zu machen. In einem 1,5 ml Röhrchen, Pipette 30μl FuGENE 6 in 600ul serum-freiem Medium (SFDMEM). Achten Sie darauf, nicht zulassen FuGENE Touch der Seite der Röhre, wie sie in das Medium abgegeben w....

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM HEK 293T-Zellen Penicillin-Streptomycin Glutamin Phosphatgepufferte Kochsalzlösung FBS	Invitrogen
FuGENE 6 Transfektionsreagenz pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG	Roche Group
Bleach	Clorox
10-cm-Zellkulturschalen 96-Well-Zellkulturschalen	Falcon BD	353003
Mehrkanalpipette	Rainin
Gefilterte Pipettenspitzen	Rainin
1,5 ml Eppendorf Röhrchen Spritzenvorsatz Spritzenfilter (0,45-μ m)	Eppendorf
Ultrazentrifugenröhrchen	Beckman Coulter Inc.
Gewebekultur-Inkubator mit 5 % CO2	Coulter
Beckman SW41T. I Rotor
Beckman ultrazentrifuge	Beckman Coulter Inc.
Fluoreszenzmikroskop	Coulter
FACS Array	Beckman Coulter Inc.