Um Lentiviren, sind DNA-Vektoren in humanen 293-Zellen transfiziert. Nach der Ernte und die Konzentration der Überstand wird Virustiter mittels Fluoreszenz-Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
RNA-Interferenz (RNAi) ist ein System von Gen-Silencing in lebenden Zellen. In RNAi, homologe Gene in der Reihenfolge auf short interfering RNAs (siRNA) sind in der post-transkriptionellen Staat zum Schweigen gebracht. Kurze Haarnadel-RNAs, Vorstufen von siRNA, kann mit Hilfe Lentivirus, so dass für RNAi in einer Vielzahl von Zelltypen werden. Lentiviren, wie das Human Immunodeficiency Virus, sind in der Lage zu infizieren sowohl teilende und nicht-teilenden Zellen. Wir beschreiben ein Verfahren, das zum Paket Lentiviren. Verpackung bezieht sich auf die Vorbereitung der zuständige Virus aus der DNA-Vektoren. Lentiviralen Vektor Produktion Systeme basieren auf einer 'split' System, wo die natürlichen viralen Genoms in einzelne Helfer Plasmid-Konstrukte wurde spaltet. Diese Aufspaltung der verschiedenen viralen Elementen in vier getrennten Vektoren vermindert die Gefahr der Schaffung von ein Replikations-fähig Virus durch zufällige Rekombination des lentiviralen Genoms. Hier sind ein Vektor, der die shRNA von Interesse und drei Verpackung Vektoren (p-VSVG, pRSV, pMDL) transient in humane 293-Zellen transfiziert. Nach mindestens einer 48-stündigen Inkubationszeit wird das Virus enthaltende Überstand geerntet und aufkonzentriert. Schließlich ist Virustiter von Reporter (fluoreszierend) Ausdruck mit einem Durchflußzytometer bestimmt.
Protokoll
Teil 1: Transfektion von HEK 293 Zellen zu Lentiviren Produce
* 24 Stunden vor der Transfektion Platte 2,5 x 10 6 Zellen in eine 10 cm Schüssel für eine Konfluenz von 50-70% am nächsten Tag.
- Starten Sie dieses Protokoll durch die Vorbereitung der DNA, mit denen man später transfizieren wird man die Zellen auf Viren zu machen. Zuerst verdünnten FuGENE 6 Transfektionsreagenz Roche, ein Lipid-Reagenz, dass Zellen nehmen DNA zu machen. In einem 1,5 ml Röhrchen, Pipette 30μl FuGENE 6 in 600ul serum-freiem Medium (SFDMEM). Achten Sie darauf, nicht zulassen FuGENE Touch der Seite der Röhre, wie sie in das Medium abgegeben w....
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Danksagungen
Sandler Asthma Basic Research Center (SABRE)
Sandler Foundation
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| DMEM HEK 293T-Zellen Penicillin-Streptomycin Glutamin Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung FBS | Invitrogen | ||
| FuGENE 6-Transfektionsreagenz pSico mCherry pMDL pRSV pVSVG | Roche Group | ||
| Chlorbleiche | Clorox | ||
| 10-cm-Zellkulturschalen 96-Well-Zellkulturschalen | Falcon BD | 353003 | |
| Mehrkanalpipette | Rainin | ||
| Gefilterte Pipettenspitzen | Rainin | ||
| 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen Spritze Spritzenfilter (0,45-μm) | Eppendorf | ||
| Ultrazentrifugenröhrchen | Beckman Coulter Inc. | ||
| Brutschrank für Zellkultur mit 5 % CO2 | Coulter | ||
| Beckman SW41T.I-Rotor | |||
| Beckman-Ultrazentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| Fluoreszenzmikroskop | Coulter | ||
| FACS Array | Beckman Coulter Inc. |
Referenzen
- Reiser, J. Production and concentration of pseudotyped HIV-1-based gene transfer vectors. Gene Therapy. , 72-7211 (2000).
- Dull, T., Zufferey, R., Kelly, M., Mandel, R. J., Nguyen, M., Trono, D., Naldini, L. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
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Nachdrucke und Genehmigungen
