Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

Zusammenfassung

Endothelial koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) sind ein viel versprechendes Instrument, um vaskuläre Homöostase und Reparatur zu studieren. ^1,2 Dieser Beitrag stellt eine neuartige Tier-serumfreien Verfahren zur Isolierung und Expansion von ECFC aus heparinisiertem erwachsenen menschlichen peripheren Blut mit gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) vermindert das Risiko von Anti-Rinder-Impfung.

Zusammenfassung

Dieser Beitrag stellt eine neuartige Recovery-Strategie für die endotheliale koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs) aus heparinisiertem aber ansonsten unmanipulierten erwachsenen menschlichen peripheren Blut innerhalb einer im Mittel 12 Tage. Nach großräumige Ausdehnung> 1x10 ⁸ ECFCs können für weitere Tests gewonnen werden. Vorteilhaft mit PHPL den Kontakt von menschlichen Zellen mit Rinderserum Antigene ausgeschlossen werden kann. Mittels Durchflusszytometrie und Immunhistochemie die isolierten Zellen können als ECFC und ihre in vitro-Funktionalität zu vaskulären Strukturen bilden können in einer Matrigel-Assay getestet werden charakterisiert werden. Weitere können diese Zellen subkutan in einem Mausmodell injiziert werden, um funktionelle, perfundierten Gefäßen in vivo zu bilden. Nach langfristige Expansion und Kryokonservierung Proliferation, erscheinen Funktion und genomische Stabilität zu erhalten. ^3,4

Dieses Tier-Protein-freie Isolierung und Expansion Methode ist leicht anwendbar, um eine große Menge an ECFCs generieren.

Protokoll

A.) ECFC ISOLATON

TAG 1:

1. Bevor Sie mit Start der Vorbereitung des Experiments das Zellkulturmedium Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2). Supplement 500ml Endothelial Basal Medium-2 mit Heparin (1ml von 1000 U / ml), 5ml 100x Lösung von Penicillin / Streptomycin (alle Sigma, St. Louis, MO; www.sigmaaldrich.com ), L-Glutamin (2 mM Endkonzentration ) und 50 ml gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL). Dann fügen Sie 0,2 ml Hydrocortison, 2 ml hFGF-B, 0,5 ml VEGF, 0,5 ml EGF, 0,5 ml IGF-1 und 0,5 ml Ascorbinsäure (sofern als SingleQuots, alle Lonza, Walkersville, MD;

Diskussion

Diese neuartige Isolierung und Expansion Methode ist ein einfaches und effizientes Verfahren, die effizienter und weniger zeitaufwendig, indem es jegliche Zellseparation (keine Dichtegradienten erforderlich) und weniger teuer als herkömmliche Techniken. Durch die Verwendung von PHPL Kontakt zu Rindern Antigene und vermeintlichen späteren xenoimmunization ist ausgeschlossen. Während der Kulturzeit kleine Blutgerinnsel bilden können, die durch die PHPL. Basierend auf unserer Erfahrung diese Blutgerinnsel haben keinen Einf.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Endotheliales Basalmedium-2	Lonza Inc.		500 ml
EGM-2 SingleQuots	Lonza Inc.		EGF, hFGF-B, VEGF, IGF-1, Hydrocortison, Ascorbinsäure
Konservierungsmittelfreies Heparin	Biochrom AG		10 U/ml pro EGM-2
L-Glutamin	Sigma-Aldrich		2 mM pro EGM-2
Penicillin und Streptomycin	Sigma-Aldrich		100 U/mL Penicillin und 100μg/mL Streptomycin pro EGM-2
Trypsin/1 mM EDTA	Invitrogen		7 ml für T75-Flasche 70 ml für CF-4
PBS
Vierstöckige Zellfabrik (CF-4)	Corning
Steriler Trichter	Corning
T75 cm2-Kultivierungsflasche (mit belüftetem Verschluss)	Corning
6-mL-Vakutainer-Röhrchen (konservierungsmittelfreies Natriumheparin)	BD Biosciences		vorgefüllt mit 108 IE/6 ml konservierungsmittelfreiem Natriumheparin
50-ml-Falcon-Röhrchen	Falcon BD
5-ml-Stripetten	Costar
25-ml-Stripetten	Costar
Squeezer	Costar
Steriler Filter mit 0,2-μm-Porengröße	EMD Millipore		2 × 500 ml pro EGM-2