Methoden zur Untersuchung des Zebrafisch Maxillary Barbel

Zusammenfassung

Der Zebrafisch Oberkiefer Barbe ist ein integumentary Sinnesorgan mit ektodermalen, mesodermalen und Neuralleiste Derivate. Wichtig ist, dass die erwachsenen Barben nach proximal Amputation zu regenerieren. Dieses Video stellt Oberkiefer Barben Entwicklung und zeigt eine chirurgische Protokoll, um die Regeneration zu induzieren, durch Sammlung, Einbett-und nachgelagerten Bildgebung von Barben Exemplare folgten.

Zusammenfassung

Barben sind hautsensorischen Anhängsel bei Fischen, Reptilien und Amphibien gefunden. Der Zebrafisch, Danio rerio, entwickelt zwei Paar Barteln-eine kurze Nase Paar und einen längeren Oberkiefer Paar. Barbel Gewebe enthält Zellen ektodermalen, mesodermalen und Neuralleiste Ursprungs, einschließlich Hautzellen, Drüsen, Gaumen, Melanozyten, Kreislauf-Gefäße und sensorischen Nerven. Anders als die meisten adulten Gewebe ist die Ober-Barbe optisch klar, so dass wir die Entwicklung und Wartung dieser Gewebearten während des gesamten Lebenszyklus zu visualisieren.

Dieses Video zeigt frühe Entwicklung des Oberkiefers Barbe (Beginn etwa einen Monat nach der Befruchtung) und zeigt eine chirurgische Protokoll, um die Regeneration im adulten Anhängsel (> 3 Monate nach der Befruchtung) zu induzieren. Kurz gesagt, ist die linke Oberkiefer Barben eines betäubten Fische mit einer sterilen Pinzette gerade distal bis zum kaudalen Rand des Oberkiefers erhöht. Eine feine, sterile Schere Frühjahr gegen die Zange positioniert, um die Barbe Welle auf dieser Ebene geschnitten, Gründung einer anatomischen Landmarke für die Amputation Ebene. Regenerative Wachstum kann in Bezug auf diese Ebene gemessen werden, und im Vergleich zu der kontralateralen Barben. Barbel Gewebe regeneriert sich schnell und erreichte maximal Nachwachsen innerhalb von 2 Wochen nach der Verletzung.

Techniken für die Analyse der regeneriert Barben gehören sezieren und Einbettung paarweise Barben (regenerieren und Kontrolle) in die Vertiefungen einer Standard-DNA-Elektrophorese-Gel. Embedded Proben sind bequem unter einem Stereomikroskop für grobe Morphologie und Morphometrie fotografiert, und kann für mehrere Wochen aufbewahrt vor Downstream-Anwendungen wie Paraffin Histologie werden, Kryoschneiden und / oder ganze Berg Immunhistochemie. Diese Methoden zu etablieren Oberkiefer Barbe als neuartige In-vivo-Gewebe-System für die Erforschung der Regenerationsfähigkeit der verschiedenen Zelltypen innerhalb des genetischen Zusammenhang mit der Zebrafisch.

Protokoll

Zebrafisch Tierhaltung

Zebrafische sind untergebracht und nach der Norm Methoden ¹ aufgezogen. Vorbei am späten Larvenstadien Frist kann der Entwicklungsstand eines Zebrafisch durch seine Standard-Länge (SL), oder die gerade Linie in Millimetern von der vordersten Punkt der Oberlippe an der Basis der Schwanzflosse (posteriormost hypural Platte) gemessen werden ^2. Bei ca. 1 Monat nach der Befruchtung (10-12 mm SL), erscheinen die Nasen-und Kieferhöhle Barben als transparent epithelialen Knospen in der Nähe des Riechgruben und auf den hinteren Ecken des Oberkiefers bzw.. Da der Zebrafisch reift, erstrecken sich die Barben in schmale, whisker Fortsätzen. Da die oberen Barbe ist größer (2-3 mm) und leichter zu manipulieren, gilt unser Protokoll nur für diese besondere Anhängsel; ähnliche Techniken konnte jedoch zu den kleineren nasalen Barben angepasst werden.

Barbel Clipping

1. Betäuben erwachsenen Zebrafisch auf die gewünschte Stufe (z. B.., 1,5-2,5 cm SL, ~ 3-6 Monate nach der Befruchtung) durch Eintauchen in 0,015% MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonat) gepuffert auf pH 7,0 im System Wasser. Beachten Sie, bis schwimmen Bewegungen zu stoppen und gill Belüftung wird langsam und regelmäßig. Je nach Größe der Fische, nimmt Vollnarkose ca. 2-5 Minuten.
2. Mit einem Aquarium Fischnetz, Transfer 1-3 Fische auf einmal zu einem gefalteten Stück nassen Papiertuch in einer Petrischale. Mit einem stumpfen Spatel, orientieren die Fische, so dass sie parallel zueinander und linken lateralen Seite bis sind. Falten Sie ein Teil der nassen Papiertuch über den hinteren Teil der Fische, die den gesamten Körper bis zum Operculum (Kiemendeckel), um die Haut und Kiemen feucht während des Verfahrens.
3. Sehen Sie sich die Petrischale unter dem Stereomikroskop, mit geringem Winkel einfallende Licht auf den Kopf zu beleuchten. Konzentrieren Sie sich auf der Basis der linken Oberkiefer-Barbe, die von der hinteren ventralen Ecke des Oberkiefers (Abb. 1) ragt.
   
   Abbildung 1.
4. Dicht erfassen die Welle der Barbe leicht distal an den Rand des Oberkiefers. Elevate die Barbe Welle und legen Sie die Backen einer spitzen Feder Schere genau proximal der Pinzette. Die Schere kann die Zange für die Stabilität berührt werden. Schieben Sie die Backen der Schere entlang der Welle der Barbe, bis die Schneide nähert sich der Rand des Oberkiefers. Schließen Sie die Schere durch die Barbe Welle geschnitten. Die amputiert Barbe, noch griff in die Zange, kann zur Fixierung oder weitere Beobachtung entfernt werden.
5. Sofort überweisen Sie den Fisch auf einem kleinen Tank mit sauberem Wasser System (~ 500 ml) enthält einen Tropfen Methylenblau zu oberflächliche Pilzinfektion zu kontrollieren. Lassen Sie den Fisch über Nacht erholen. Am nächsten Morgen kehren die Fische, die Aufzucht-System. Barbel Regeneration nach 2 Wochen maximal.

Agar Einbettung von Matched Pairs Barbel

1. Sammeln Sie Fische durch geeignete Euthanasie Technik und fix in einem 50 ml-Röhrchen mit 4% Paraformaldehyd-Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Rühren bei 4 ° C über Nacht. Die Fixierlösung sollte mindestens das Zehnfache des Volumens des Gewebes werden. Nach der Fixierung von Paraformaldehyd Abfälle in einer zugelassenen Behälter und spülen Sie das Gewebe gründlich in mehrere Änderungen der PBS.
2. Bereiten Sie sich in einem 250 ml-Glasflasche 150 ml 2% Agarose (T _m ~ 37 ° C) in destilliertem Wasser. Hitze mit einer Mikrowelle oder Heizplatte, Rühren in regelmäßigen Abständen, bis sie vollständig aufgelöst. Äquilibrieren das geschmolzene Lösung in einem 50-60 ° C Wasserbad.
3. Bauen Sie ein Standard-Gel-Elektrophorese rig, indem Sie einen kleinen gedichtete Gelform (10 x 10 cm; ~ 100 mL Gelvolumen) fest gegen die Seiten der Pufferkammer. Fügen Sie 2-4 kleinen Zähnen Probe Kämme (4 x 1,5 mm).
4. Auf einer ebenen Fläche, gießen Sie die geschmolzene Agarose in die Form gerade bedeckt die Basis der Waben bilden sehr seichten Brunnen. Sofort setzen die übrig gebliebenen Agarose zurück in den warmen Wasserbad, das wird später verwendet werden, um das Gewebe (Schritte 9-12) einbinden. Legen Sie ein langes Glas Pasteur Pipette in den Kolben der Pipette auf die gleiche Temperatur wie die Agarose zu halten.
5. Lassen Sie das Gel zu härten für 20-30 Minuten. Entfernen Sie die Kämme, entfernen Sie dann das Gel enthaltende Form der gehärteten Gel aus der Pufferkammer. Fest Band die offenen Seiten des Gels Form mit Labor-Band so das Gel nicht rutscht aus. Diese Band sollte einige Millimeter über der Oberfläche der Agarose zu verlängern, so dass zusätzliche Agarose später hinzugefügt werden können (Schritt 13).
6. Positionieren Sie die Gelform auf der Bühne ein Stereomikroskop. Magnify einen leeren Brunnen und bringen die Kanten in den Fokus.
7. Auf die Oberfläche der Agarose neben dem gut, einen Tropfen von Wasser oder Puffer, der den festen Barben Proben (zB, regenerieren und Kontrolle). Using gebogen Insektennadeln, ziehen Sie den feuchten Proben in den Brunnen und schieben Sie sie nach unten. Orient die Barbe Wellen parallel zueinander ausgerichtet und an gegenüberliegenden langen Kanten des Brunnens. Die Oberflächenspannung wird dazu beitragen, halten das Gewebe in Position.
8. Wenn Sie bereit sind zu verankern, mit einem feinen Pipettenspitze oder die Ecke eines Labors Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit aus dem Brunnen zu entfernen. Arbeiten Sie schnell, um nicht zu lassen, das Gewebe austrocknen.
9. Mit der erwärmten Glas Pasteur Pipette vorsichtig Pipette frisch geschmolzene Agarose in und um die Proben zu den Barben Gewebe an Stelle abzudichten. Nicht überfüllen. Bevor die Agarose erhärtet, machen Last-Minute-Korrekturen mit dem Insekt Pins.
10. Legen Sie eine nummerierte Papier Probe Etikett neben dem Brunnen und sichern Sie sie mit einem kleinen Tropfen Agarose.
11. Wiederholen Sie die Schritte 6 bis 10 für jede Vertiefung der Proben.
12. Wenn für die Bild-Kalibrierung gewünscht, legen Sie ein Blatt Papier mit einem gedruckten Mikrometerbereich (zB http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) in den Boden eines leeren Brunnen. Streichen Sie das Papier auf den Boden des Brunnens und decken Sie es mit warmen Agarose.
13. Nachdem alle Proben eingebettet sind, wird die Oberfläche des Gels werden unregelmäßig, mit gehärteter Tropfen Agarose. Legen Sie das Gel auf eine ebene Fläche und sanft in zusätzliche geschmolzener Agarose pour bis die Oberfläche gleichmäßig ist. Verwenden Sie die kleinste Menge an Agarose notwendig, um eine glatte Oberfläche zu erhalten, zu viel Agarose wird Durchlicht-Fotografie im Dunkeln. Lassen Sie diese oberste Schicht zu härten.
14. Das Gel kann nun auf der Bühne ein Stereomikroskop auf grobe Morphologie für jede Barbe Paar Rekord fotografiert werden. Bild Kalibrierung durch Fotografieren der embedded Mikrometerbereich erreicht.
15. Das ganze Gel gespeichert eingewickelt in feuchte Papiertücher und versiegelt in einem Plastikbeutel bei 4 ° C für mehrere Wochen.
16. Zur weiteren Analyse können Agar Blöcke mit zwei gepaarten Barben aus dem Gel geschnitten werden mit einem Skalpell oder einer Rasierklinge und verarbeitet Paraffin Histologie oder Kryoschneiden nach Standardmethoden ^3,4. Alternativ können einzelne Barben aus der Agarose seziert werden mit feinen Nadeln, in Wasser gespült, und verarbeitet für andere Downstream-Anwendungen (zB ganze-mount Immunhistochemie oder die konfokale Mikroskopie).

Diskussion

Der Zebrafisch Oberkiefer Barbe ist eine nicht ausgelastete Gewebe für die Untersuchung des Wachstums, Wartung und Erneuerung von mehreren Zelltypen im Zebrafisch. Obwohl die Barbe Anhängsel hat kein Mensch analog, sind die Zelltypen enthält hoch konserviert, die es ermöglichen, Haut, Drüsen, Melanozyten, Kreislauf-Gefäße und Nerven in eine optisch klare und anatomisch einfachen zylindrischen Struktur zu studieren. Ähnlich wie bei den gut untersuchten Schwanzflosse kann Barben Gewebe induziert durch Amputation zu regenerieren. Mit der Grenze des Ober-als anatomische Landmarke, kann die Amputation Flugzeug genau platziert werden, die Messung der Barbe Nachwachsen. Für einen erfahrenen Operateur nimmt jeder Operation nur ein paar Sekunden. Recovery ist schnell, und wir haben bisher keine kurz-oder langfristige Auswirkungen auf Fische Verhalten erkannt. Zebrafisch mit einem Ober-Barben schwimmen, essen und Rasse so effektiv wie nicht-chirurgischen Kontrollen und haben vergleichbare Überlebensrate bis zum Zeitpunkt der Gewebe Sammlung, bis zu 6 Monate nach der Operation. Die physiologische Wirkung dieser Operation voraussichtlich minimal sein, weil 1) die extraorale Geschmacksknospen auf der Barbe durchgeführt auch auf vielen anderen Teilen der Fisch Epithel, einschließlich der Lippen, Wangen und Kopf ⁵ gefunden werden, und 2) unterscheiden Gaumen erscheinen auf die regenerierende Barben innerhalb von 72 Stunden (LeClair et al., unveröffentlichte Daten). Das macht die Ober-Barbe ein minimal-invasives System zur Untersuchung der Wundheilung, Revaskularisation und Reinnervation im Rahmen eines erwachsenen Wirbeltieren.

Nach der chirurgischen Induktion von Regeneration, kann Barben in Abständen für morphometrische Messung und / oder mikroskopische Analyse von fixiertem Gewebe gesammelt werden. Praktischerweise ist der Oberkiefer Barben etwa die Länge (2-3 mm) und Durchmesser (100-200 mm) eines Zebrafisch-Embryos, die Erleichterung der Anwendung von vielen Standard-Protokollen, einschließlich Paraffin Histologie, Kryoschneiden, ganze-mount Immunhistochemie und in situ Hybridisierung. Zusammen genommen machen diese Features die oberen Barben ein sehr machbar in vivo Modell für die Untersuchung die Reparatur von Gewebe und Regeneration.

Materialien

Mikroskop Ausstattung

Ein Stereo-Binokular mit Durchlicht und Vorfall Glasfaser-Beleuchtung ist für Barben Clipping und Agar Einbettung erforderlich.

Barbel Clipping

• Fisch System Wasser
• 2 Zebrafisch Kreuzung Tanks
• MS-222 (Ethyl-3-Aminobenzoesäure Methansulfonat; Sigma Chemical # E10521-10G)
• sterile 120-mm Petrischale
• nasse Papiertücher
• stumpfen Spatel
• Dumont Nr. 55 Bio Inox Pinzette (Fine Science Tools # 11255-20)
• Mini-Vannas Frühjahr Schere (Fine Science Tools # 15000-00)
• Methylenblau Antimykotikum (Drs. Foster & Smith # CD-905781)
• kleines Aquarium fishnet

Tissue-Sammlung und Agar Einbettung

• 4% Paraformaldehyd in 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PF-PBS), aliquotiert in 50 ml konische Röhrchen und bei -20 ° C bis zur Verwendung
• 1x Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,27 bis 6)
• 250 ml Glasflasche
• 2% Agarose in destilliertem Wasser
• Standard klein Agarosegelelektrophorese rig (Gel size = ~ 10 cm im Quadrat)
• kleinen Zähnen Elektrophorese-Kamm (Kamm Größe 4 x 1,5 mm)
• warmen Wasserbad (50-60 ° C)
• Labor-Band
• schwarz emailliert Insektennadeln, Größe 000 (Fein Science Tools # 26000-25)
• 1-2 Pin-Halter (Fine Science Tools # 26016-12)
• 9-Zoll-Glas Pasteurpipette
• Peleusball oder Pumpe
• Laborwischtuch
• kleine Papier-Etiketten
• (Optional) gedruckt Kalibrierungsskala
• nasse Papiertücher
• zip-Schließung Plastiktüte
• Skalpell / Rasierklinge (zum Ausschneiden Agar-Blöcke)