Method Article

Mess-Diffusionskoeffizienten über Zwei-Photonen-Fluorescence Recovery After Photobleaching

DOI:

10.3791/1636

⸱

February 26th, 2010

 , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Rochester, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In diesem Artikel beschreiben wir das Verfahren zur Messung von Diffusionskoeffizienten mittels Multi-Photonen-Fluoreszenz-Erholung nach Ausbleichen. Wir werden durch die Angleichung der Laser entlang der optischen Pfad zu der Probe und Bestimmung der richtigen experimentellen Parameter beginnen, dann weiter generiert und schließlich passende Fluoreszenz Erholung Kurven.

Abstract

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Multi-Fluorescence Recovery After Photobleaching ist ein Mikroskopie-Technik verwendet, um den Diffusionskoeffizienten (oder analoge Transport-Parameter) von Makromolekülen zu messen, und kann sowohl angewendet werden

Protocol

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1. Richten Sie die Optik.

Die wichtigsten Geräte für einen MP-FRAP-Experiment sind: eines modengekoppelten Laserquelle, Pockels-Zelle (für Strahlmodulation), Impulsgeber, dichroitische, Objektiv, Fluoreszenzemission Filter, gated Photomultiplier und einem Datenerfassungssystem (Photonen-Zähler und Mehrkanal-Scaler).

2. Bestimmen Sie sicher überwachen Kräfte.

  1. Dämpfen Sie den Laser auf einen niedrigen, aber vernünftig, Energie zur Erzeugung von Fluoreszenz in der Probe.
  2. Fokus in der Probe.
  3. Set ein Photon Zähler zu integrieren über eine Zeitskala viel länger als die erwartete Fluoresz....

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Discussion

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Die Macht der Multi-Photonen-Fluoreszenz-recovery after photobleaching liegt in seiner Fähigkeit, dicken Proben mit 3D-Auflösung Sonde. Seit seiner Entwicklung in den 1990er Jahren hat MP-FRAP verwendet worden, um den Diffusionskoeffizienten (oder analoge Transport-Parameter) in Zellkörper, ex vivo dicken Gewebeschnitten und in vivo Gewebe und Interstitium bestimmen. In diesem Artikel haben wir die notwendige Ausrüstung, um ein MP-FRAP-Experiment, sowie das richtige Verfahren für die Ausrichtung des St.......

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Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde durch ein Department of Defense Era of Hope Scholar Award (Nr. W81XWH-05 bis 0396) und eine Pew Scholar in der Biomedical Sciences Award Edward B. Brown III finanziert.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ti:Saphir-LaserNewport Corp.Mai Tai
Pockels CellConoptics350-80
Laser-Scanning-MikroskopOlympus CorporationFluoview
Siegroitischer KurzpassspiegelChroma Technology Corp.670 DCSX-2P
Photomultiplier-RöhreHamamatsu Corp.HC125-02
PhotonenzählerStanford Research SystemsSR 400
Mehrkanal-Scaler/AveragerStanford Research SystemsSR 430
ImpulsgeneratorStanford Research SystemsDG 535
FITC-BSAInvitrogen--

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Biophys J. 60, 73-76 (1990).
  2. Brown, E. B., Wu, E. S., Zipfel, W., Webb, W. W. Measurement of molecular diffusion in solution by multiphoton fluorescence photobleaching recovery.

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Two photon Fluorescence RecoveryFluorescence Recovery After PhotobleachingDiffusion Coefficient MeasurementLaser Beam AlignmentPockels Cell ModulationPhoton Counting AnalysisLabVIEW AutomationMATLAB Curve FittingAqueous Fluorescent DyeFluorescence Recovery Curve

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