تحلل الدم ميكروفلويديك الآلي بروتوكول لتخصيب اعارة خلايا الأنوية

Summary

وقد تم تطوير جهاز ميكروفلويديك الآلي لتعميم الأنوية تخصيب الخلية من الدم المحيطي عبر تحلل كرات الدم الحمراء التي تضمن عزل عينة ذات جودة عالية من دون خسارة الخلية.

Abstract

في هذا التقرير هو مفصل في البروتوكول الآلي للحصول على جهاز ميكروفلويديك الدم تحلل. تعميم خلايا الأنوية (CNCs) ، بما في الكريات البيضاء وخلايا بطانة الأوعية الدموية ، وتوفير منصة مثالية للحصول على وضع محدثة عن حالة المناعي للفرد. بروتوكول ميكروفلويديك يسمح لتخصيب CNCs دون فقدان الخلية عينة انتقائية وتقلب بسبب إعداد المستخدم بوساطة الخطوات. لفترة وجيزة ، ويتضمن البروتوكول تصنيع الجهاز ، وجمع العينات ، إعداد الجهاز ، وتشغيل الدم من خلال غرفة ميكروفلويديك. داخل الجهاز هو مختلط الدم بسرعة كاملة مع الماء منزوع الأيونات لنحو 10 ثانية في 50 ميكرون × 150 قناة ميكروفلويديك ميكرون. في هذا الوقت هي lysed الكريات الحمراء تمتد بسبب ظروف ناقص التوتر. هياكل متعرجة على الجزء السفلي من القناة ضمان خلط دقيق والتعرض للخلايا في بيئة ثابتة. يتم إرجاع الخلايا المتبقية لظروف متساوي التوتر في الخروج من الجهاز ، باستخدام بارافورمالدهيد ثابتة 2 ٪ ، وطرد لفصل كرات الدم الحمراء من الحطام CNCs ، وعلقت في تدفق العازلة للتلوين وتحليلها من جانب التدفق الخلوي. تظهر النتائج نظيفة المؤامرات مبعثر تدفق الخلوي مع السكان CNC المحفوظة. أهمية هذا الجهاز والبروتوكول يأتي في دراسة وفهم الأمراض المرضية عن طريق التحليل للسكان باستخدام الحاسب الآلي. وبالتالي ، فإن تظاهر الأتمتة والفعالية والبساطة للبروتوكول ميكروفلويديك.

Protocol

الجزء 1. ميكروفلويديك جهاز تلفيق

تم إنشاء قالب السيليكون الرئيسي للجهاز تحلل باستخدام تقنيات الطباعة بصفائح معدة ضوئيا ميكروفلويديك القياسية مع المعدات في جامعة لويزفيل غرف الأبحاث [1]. وقد استخدم أوتوكاد (أوتوديسك ، وشركة ، وسان رافائيل ، كاليفورنيا) لإنشاء قناع الشفافية (Fineline التصوير ، كولورادو سبرينغز ، أول أكسيد الكربون) لإنشاء النسخ المتماثلة السلبية للقنوات. كانت ملفقة الجهاز ميكروفلويديك تحلل من القالب الرئيسي السيليكون باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة مع بولي الاستومر (dimethylsiloxane) (PDMS ؛ داو كورنينغ ، ميدلاند ، ميتشيغن). تم الإفراج عن الاستومر مع القنوات منسوخة ، واللكم والثقوب وصول القناة مع إبرة عيار 20 (أجزاء صغيرة ، ميرامار ، فلوريدا). وكان الرهينة لا رجعة فيه الرقاقة PDMS إلى شريحة الزجاج عبر البلازما الأكسجين واختبار التجريب.

الجزء 2. بروتوكول لتشغيل جهاز تحلل

بعد مفتعلا الجهاز ميكروفلويديك واختبارها ، والتجارب مع تحلل كرات الدم الحمراء على استعداد للبدء. تفاصيل المقطع التالي على البروتوكول للجهاز ميكروفلويديك.

2.1 جمع العينات

1. جمع 4 مل من عينة دم من الوريد المرفقي وسيطة ، وعلى المنوال الساعد الأمامي للمريض مع الهيبارين وتخثر في اثنين 2 مل vaccutainers أعلى الخضراء.
2. تجاهل first أنبوب 2 مل كما أنه يحتوي على خلايا بطانية ناضجة فكها (ايجابيات كاذبة).
3. Resuspend الأنبوب الثاني لمزيج مع الهيبارين في الدم عن طريق تحول صعودا وهبوطا ، حفظ فورا على الجليد.
4. نقل 1 مل من الدم إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف. عملية عينة الدم فورا (في غضون ساعة واحدة من جمع).

2.2 الجهاز ميكروفلويديك مع رئيس PBS

1. الحصول على جهاز ميكروفلويديك المستعبدين من الزجاج. الصحافة تناسب الأنابيب وصول (أجزاء صغيرة ، ميرامار ، فلوريدا) بقطر أكبر قليلا في مداخل ومنافذ (الشكل 1).
2. نعلق إبرة حقنة عيار 30 (أجزاء صغيرة ، ميرامار ، فلوريدا) إلى الأنبوب في كل من المنافذ ، وتوفير واجهة الماكرو إلى الجزئي.
3. ملء حقنة 1 مل مع 1X PBS وتأكد للتخلص من الفقاعات التي عبها إبرة المحقنة. توصيل PBS محملة حقنة 1 مل 1 إلى مدخل على الجهاز ميكروفلويديك. دفع الحقنة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X بلطف باليد حتى حل ينبع من مدخل 2 ، ومن ثم المشبك فورا مدخل 2 مع مقطع مكتب الموثق القياسية
4. الاستمرار في دفع السوائل PBS 1X حتى تصل إلى الميناء منفذا للجهاز على microfluidics. مرة واحدة في حل ينبع من مأخذ ، المشبك الأنبوب مع مخرج آخر مقطع الموثق.
5. الاستمرار في دفع حقنة 1 مل حتى 1X PBS يتدفق من مدخل 3 ، والمشبك 3 مدخل الميناء مع مكتب آخر مقطع الموثق. هو الآن على microfluidics معبي الجهاز بالكامل.

الشكل 1. تخطيطي يظهر منافذ الجهاز عن حلول ومخرج منها.

2.3 التحضير للمضخات المحاقن والحل

1. لمعايرة مضخات اتبع الخطوات التالية :
   1. لحقنة هارفارد مضخة كبيرة (جامعة هارفارد ، والدكتوراه 22/2000 الجزء # 702000) : تعيين التكوين قطرها إلى 22.5 مم ، معدل التدفق 600 ميكرولتر / دقيقة.
   2. لمضخة صغيرة الحقنة هارفارد (جامعة هارفارد ، بالاضافة الى الجزء بيكو # 702213) : تعيين التكوين إلى قطرها 4،61 ملم ، ومعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة.
2. حقنة ملء واحدة 30 مل مع الماء منزوع الأيونات معقمة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال سحب الحل مباشرة من الأنبوب مخروطية 50 مل. (تسمية المحقنة)
3. ملء الحقنة الثانية مع 30 مل 2X الفوسفات مخزنة الملوحة بارافورمالدهيد (PBS) 2 ٪ (PFA) باستخدام الإجراء المذكورة في الخطوة 9. (تسمية المحقنة)
4. ملء حقنة 1 مل مع 1X PBS من aliquots المخزنة في أنابيب مخروطية 15 مل ، وذلك باستخدام الإجراء المذكورة في الخطوة 9.
5. ربط 30 مل ماء منزوع الأيونات حقنة لمدخل 2 و 30 مل حقنة PBS 2X إلى مدخل 3 (تأكد من فخ ر ارتداء فقاعات في أنابيب أو الجهاز على microfluidics). إزالة المشبك من 2 و 3 مداخل ومنافذ أنابيب. توصيل 1X PBS حقنة 1 مل في مدخل 1. تجنب إدخال فقاعات عن طريق ملء الإبرة المحاقن مع السائل ، والذي يربط بين حقنة وعبها إبرة حقنة للتخلص من الفقاعات.

تحلل كرات الدم الحمراء 2.4

1. كل مجموعة من الحقن على مضخات هارفارد الصحيح كما هو مبين أدناه :
   1. تعيين المحاقن منهما 30 مل (واحد يحتوي على عقيمة ، غير المتأينة المياه وغيرها مع PBS 2X ، PFA 2 ٪) معا على ضخ حقنة كبيرة هارفارد.
   2. تعيين حقنة 1 مل (التي تحتوي على 1X PBS) على مضخة صغيرة حقنة هارفارد.
   3. وضع أنابيب منفذا في جامع النفايات (50 مل أنبوب مخروطي الشكل الذي يسمى ثaste).
2. بدوره على مضخة كبيرة حقنة هارفارد (المحاقن مع 30 مل) والسماح لها الترشح لدقيقة واحدة. (تأكد من عدم وجود فقاعات وجود تسرب في الجهاز أو في الأنبوب).
3. بدوره على مضخة صغيرة حقنة هارفارد والسماح لها يرشح نفسه لدقيقة إضافية. (تأكد من عدم وجود فقاعات وجود تسرب في الجهاز أو في الأنبوب). توقف المضخات. الجهاز على microfluidics الآن جاهزة للاستخدام.
4. إزالة حقنة 1 مل تحتوي على 1X PBS من مضخة صغيرة حقنة هارفارد.
5. بعد الحصول على عينة من الدم ، وملء محقنة 1 مل مع 0.05 مل من 1X PBS عقيمة دون محاصرة أي فقاعات. المقبل ، وملء المحقنة مع 0.5 مل من الدم تم الحصول عليها من الأنبوب إيبندورف. (وسوف حقنة 1 مل تحتوي الآن على الحجم النهائي من 0.55 مل من الدم و1X العازلة PBS). ملاحظة : حافظ على رأسي بينما ملء محقنة لتجنب اختلاط PBS 0.05 مل مع الدم.
6. حقنة تحتوي على توصيل الدم إلى مدخل 1 وجبل المحقنة بعناية (تجنب دفع الدم عبر الأنابيب في الجهاز) على مضخة صغيرة حقنة هارفارد (هي التي شنت المحقنة إلى مضخة عمودية).
7. إزالة أنابيب مخرج من أنبوب النفايات ووضع أنبوب الطرد المركزي نظيفة 50 مل في مكانها ووضعها على دلو من الجليد.
8. التبديل على ضخ حقنة كبيرة هارفارد الأولى والسماح لها الترشح ل1 دقيقة. بدء جمع عينة من مأخذ الطرد المركزي في أنبوب 50 مل.
9. التبديل على مضخة صغيرة حقنة هارفارد.
10. مرة واحدة في عينة من الدم في حقنة 1 مل قد سافر تماما من خلال الجهاز ، ووقف كل من المضخات. هذا ينبغي أن يستغرق حوالي 20 دقيقة.
11. الطرد المركزي العينة التي تم جمعها لمدة 5 دقائق في 350 XG في درجة حرارة الغرفة مع قبالة الفرامل.
12. طاف إزالة غيض من خلال وضع ماصة في الجانب الآخر من الكريات البيضاء. كما طاف إزالة أكبر قدر ممكن ، والحطام الخلية الحمراء خاصة ، دون الإخلال بيليه الأبيض.
13. Resuspend العينة في 1 مل من تدفق العازلة (1X PBS ، 1 ٪ BSA [البقري ألبومين المصل] ، 2 ٪ PFA) بواسطة pipetting صعودا وهبوطا. نقل العينة إلى أنبوب 1.5 مل إيبندورف.
14. Microcentrifuge العينة التي تم جمعها لمدة 5 دقائق عند 4 XG في درجة حرارة الغرفة. استخدام نفس الدقة قبل لإزالة طاف.
15. Resuspend العينة في 1 مل من تدفق العازلة التي vortexing.

2.5 التحضير لتحليل تدفق cytometric

1. لتحليل العينات باستخدام التدفق الخلوي ، إضافة ميكرولتر من 100 عينة لتدفق أنبوب الخلوي.
2. لميكرولتر 100 من العينة إضافة الضد المحدد (ضمان التركيز الصحيح).
3. السماح لاحتضان عينة لمدة 30 دقيقة في 40 C.
4. تغسل مرتين مع تدفق العازلة قبل التدفق الخلوي. الخطوة تتضمن غسل مضيفا 250 ميكرولتر من تدفق العازلة ، vortexing ، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 XG ، وإزالة السائل بدوره طاف مع واحدة من أنبوب التدفق الخلوي.
5. Resuspend وبيليه في 250 ميكرولتر من تدفق العازلة. نموذج جاهز للتحليل التدفق الخلوي.

ممثل النتائج

تم تشغيل كامل الدم من خلال الجهاز ميكروفلويديك تحلل وبروتوكول آخر لمعالجة والتخلص من الكريات الحمراء وتعميم تخصيب خلايا الأنوية (CNCs). وسوف تسفر عن نتائج مثالية التدفق الخلوي نظيفة مؤامرة مبعثر مع السكان CNC منفصلة. عرض أدناه في الشكلين 2 و 3 المقارنات مؤامرة مبعثر لعينة من الدم الكامل دون تحلل كرات الدم الحمراء وكريات الدم الحمراء مع تحلل بواسطة بروتوكول ميكروفلويديك مع محاور على النحو المبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) الخفيفة. ويمكن ملاحظة أن بروتوكول تخصيب ميكروفلويديك هو ضروري للحصول على التدفق الخلوي نظيفة مؤامرة مبعثر.

الشكل 2. تدفق مؤامرة مبعثر الخلوي من عينة دم كامل دون تحلل كرات الدم الحمراء مع FSC ومحاور التعاون بين بلدان الجنوب.

الشكل 3. مؤامرة التدفق الخلوي مبعثر تعميم الخلايا الأنوية مع تحلل كرات الدم الحمراء ميكروفلويديك صفت من قبل السكان مع FSC ومحاور التعاون بين بلدان الجنوب. المنطقة 1 (الحمراء) تمثل الخلايا الليمفاوية ، المنطقة 2 (الخضراء) تمثل حيدات ، والإقليم 3 (الأزرق) يمثل المحببة ، والمنطقة 4 (الأرجواني) لم يتسم.

ازالة الحطام بواسطة ماصة الخلايا الحمراء في البروتوكول المهم أيضا عند الضرورة. أدناه في الشكل (4) هو مؤامرة مبعثر تبين وجود فائض من حطام خلية حمراء. وإن لم يكن يعكر مؤامرة مبعثر كما في الشكل 2 ، ويجب حساب واحد للأحداث وأضاف بسبب الحطام كرات الدم الحمراء خلال تحليل البيانات.

الشكل 4. مؤامرة مبعثر التدفق الخلوي تصور حطام خلية حمراء ، ينظر إليها على أنها كتلةالأحداث في المنطقة 5 (السماوي).

وبالنسبة لبعض خلايا تلطيخ علامات النمط الظاهري توليد الأجسام المضادة أيضا نتائج مميزة. في الأرقام التالية هي البقع النمط الظاهري الضد لمدة 3 السكان الكريات البيض متميزة : الخلايا الليمفاوية ، وحيدات ، والمحببة. الشكل 5 يصور السكان اللمفاويات تآمر مع محاور وCD3 CD4. وترد وحيدات والمحببة في الأرقام 6-7 مع محاور على النحو FSC مقابل CD14 وCD66b ، على التوالي.

الشكل 5. مؤامرة مبعثر الخلوي تصور تدفق الخلايا الليمفاوية مع CD3 CD4 والفؤوس.

الشكل 6. مؤامرة مبعثر التدفق الخلوي تصور وحيدات مع FSC محاور CD14.

الشكل 7. مؤامرة مبعثر تدفق الخلوي تصور المحببة مع FSC CD66b والفؤوس.

Discussion

وقد افاد الآلي تحلل الدم ميكروفلويديك البروتوكول. ضمن البروتوكول هي الخطوات الحاسمة الجدير بالذكر. في القسم P.2.1 ، فمن المهم أن تجاهل فيال الدم الاولى التي جمعت وكانت العينة تحتوي على خلايا بطانية ناضجة فكها بوصفها ايجابيات كاذبة. أيضا التأكد من تشغيل عينة من الدم في غضون ساعة من جمعها. فتيلة جهاز ميكروفلويديك في القسم P.2.2 ، من المهم في البداية للتخلص من الفقاعات. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي للمرء تجنب تقديم فقاعات عند إرفاق المحاقن جديدة للإبر في جميع أنحاء البروتوكول. عند ملء الحقنة 1 مل مع الدم في القسم P.2.4 ، يجب على المرء أن يتذكر أولا إضافة إلى 1X PBS والدم ، مع الحفاظ على كل حقنة العمودية لتفادي خليط من الحلين. قبل البدء في ضخ حقنة دفع عينة من الدم ، وضمان ضخ حقنة كبيرة بحيث تم تشغيل هذا النظام بأقصى سرعة. بعد انتهاء تشغيل العينة من خلال الجهاز وطرد تم إزالة بعناية بقدر طاف وقت ممكن ، بما في ذلك الحطام خلية حمراء ، من دون إزعاج بيليه الأبيض. وأضاف أخيرا ، في القسم P.2.5 اتباع البروتوكول المصنعة ليالي لضمان تركيز الأجسام المضادة لتصحيح العينة 100 ميكرولتر.

تطبيقات بروتوكول ميكروفلويديك هائلة في مجال البحوث السريرية. استجواب الوضع المناعي للفرد من حيث يولد CNCs معلومات مهمة عن الحالة الصحية ويمكن أن تساعد في تشخيص وفهم المرضية المرض. الوصول إلى هؤلاء السكان عن طريق جمع CNC عينة من الدم هو أسهل وأكثر راحة من التحليلات التعبير التي تنطوي على أنسجة الورم الإنسان. يجب أن تدرس هذه الخلايا الأنوية في التداول للمرء أن يكون قادرا على إثراء السكان من مكونات الدم الأخرى ، بما فيها كريات الدم الحمراء ، والوظيفة الرئيسية للجهاز عنها. وبالتالي ، فإن مثل هذه الدراسات تستفيد كثيرا من البروتوكول تحلل الدم ميكروفلويديك.

أهمية بروتوكول ميكروفلويديك يخرج من حيث التطبيقات. لأنه مطلوب الأنوية تخصيب خلية في الدراسات السريرية من الدم ، والبروتوكول التي تتطلب خبرة قليلة وسهلة بوساطة الخطوات التي تعطي نتائج واضحة ومتسقة هو المهم. بروتوكول يضمن اتساق ميكروفلويديك من خلال الأتمتة والتعرض للرقابة من الخلايا لبيئات قاسية. مع توحيد البيانات بين المختبرات السريرية وسوف تكون قابلة للمقارنة مباشرة [2].

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning
Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent	Dow Corning
30-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-301PL-25
Tygon tubing (.010" ID)	Small Parts, Inc.	TGY-010
20-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-201PL-25
Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000)	Harvard Apparatus	702000
Syringe Pump (Harvard Pico Plus)	Harvard Apparatus	702213
Flow cytometry tubes	DB Biosciences	352052
Antibody stains	DB Biosciences
1.5 ml Eppendorf tubes	Fisher Scientific	05-402-25
50 ml tube	Fisher Scientific
1 ml syringe	Fisher Scientific
30 ml tube	Fisher Scientific
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific
10X PBS	Fisher Scientific