Automatisierte Microfluidic Blut Lysis-Protokoll zur Anreicherung von zirkulierenden Zellen mit Zellkern

Summary

Ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät wurde für den Umlauf kernhaltigen Zelle Bereicherung aus dem peripheren Blut über Erythrozytenlyse dass die Isolierung von hoher Qualität Probe stellt sicher, ohne Zellverlust entwickelt.

Abstract

In diesem Bericht das Protokoll für ein automatisiertes mikrofluidischen Blut Lyse Gerät ist detailliert. Zirkulierende kernhaltigen Zellen (CNCs), einschließlich Leukozyten und Endothelzellen, bieten eine ideale Plattform, um einen aktualisierten Status auf das Immunsystem Zustand eines Individuums. Die Mikrofluidik-Protokoll ermöglicht die Anreicherung von CNCs ohne selektive Zellverlust und Probenvorbereitung Variabilität durch Benutzer-vermittelten Schritte. Kurz gesagt, enthält das Protokoll Bauelementherstellung, Probenentnahme-, Geräte-Setup, und läuft das Blut durch den mikrofluidischen Kammer. Innerhalb des Gerätes Vollblut wird schnell mit VE-Wasser für ca. 10 Sekunden in eine 50 micron x 150 micron mikrofluidischen Kanal gemischt. In dieser Zeitspanne werden die Erythrozyten durch hypotone Bedingungen lysiert. Herringbone Strukturen auf dem Boden des Kanals eine gute Durchmischung und Exposition von Zellen, um eine konstante Umgebung. Verbleibende Zellen sind auf isotone Bedingungen an der Ausfahrt des Gerätes zurück, fixiert mit 2% Paraformaldehyd, zentrifugiert, um Erythrozyten Trümmer CNCs trennen und suspendiert in Flow-Puffer für die Färbung und Analyse mittels Durchflusszytometrie. Die Ergebnisse zeigen, sauber Durchflusszytometrie Streudiagramme mit CNC Populationen gerettet. Bedeutung dieses Gerät und Protokoll kommt in der Studie und das Verständnis der Pathogenese der Erkrankung durch eine Analyse der CNC Populationen. Daher sind Automatisierung, Effizienz und Einfachheit der mikrofluidischen Protokoll demonstriert.

Protocol

Teil 1. Microfluidic Bauelementherstellung

Ein Silizium-Master-Form der mikrofluidischen Lyse Gerät wurde mit Standard-Photolithographie-Techniken mit dem Gerät in der University of Louisville Reinraum [1]. AutoCAD (Autodesk, Inc., San Rafael, CA) wurde verwendet, um eine Transparenz-Maske erzeugen (Fineline Imaging, Colorado Springs, CO) zu negativen Repliken der Kanäle zu erstellen. Die mikrofluidischen Lyse Gerät wurde von der Silizium-Master-Form mit weichen lithographischen Techniken mit dem Elastomer Poly (dimethylsiloxan) (; Dow Corning, Midland, MI PDMS) hergestellt. Das Elastomer mit den replizierten Kanäle veröffentlicht wurde, und Channel Access Löcher wurden mit einer 20-Gauge-Nadel (Small Parts, Miramar, FL.) Gestanzt. Die PDMS-Wafer wurde irreversibel auf ein Glasplättchen über Sauerstoff-Plasma gebunden und getestet für Experimente.

Part 2. Protokoll für den Betrieb Lyse Gerät

Nach dem Mikrofluidiksystem hergestellt worden und getestet wurde, sind Experimente mit Erythrozytenlyse bereit zu beginnen. Im folgenden Abschnitt das Protokoll für die Mikrofluidik-Gerät.

2,1 Probengewinnung

1. Sammeln Sie 4 ml der Blutprobe von V. mediana cubiti, auf der vorderen Unterarm Vene des Patienten mit Heparin als Antikoagulans in zwei 2 ml grüne Spitze vaccutainers.
2. Discard ersten 2 ml-Tube, wie es verdrängt reifen Endothelzellen (false positives) enthält.
3. Resuspendieren der zweiten Röhre an Heparin mit Blut mischen, indem Sie nach oben und unten; sparen sofort auf Eis.
4. Transfer 1 ml Blut in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Prozess der Blutprobe sofort (innerhalb einer Stunde nach der Entnahme).

2,2 Prime Mikrofluidikvorrichtung mit PBS

1. Besorgen Sie sich einen Mikrofluidikvorrichtung verklebt auf Glas. Press-fit Zugang Schlauch (Small Parts, Miramar, FL) von etwas größerem Durchmesser in den Ein-und Ausgang (Abbildung 1).
2. Bringen Sie einen 30-Gauge-Injektionsnadel (Small Parts, Miramar, FL), um den Schlauch an jedem der Eingänge, die Bereitstellung der Makro bis Mikro-Schnittstelle.
3. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 1X PBS und vergewissern Sie sich, um loszuwerden, Blasen, die durch flicking die Nadel der Spritze. Schließen Sie das PBS-geladen 1 ml Spritze mit dem Einlass 1 auf der Mikrofluidikvorrichtung. Drücken Sie die Spritze mit dem 1X PBS vorsichtig von Hand, bis die Lösung fließt aus Einlass 2 und dann sofort Klemme Einlass 2 mit einem Standard-Office-Sammelmappe Clip
4. Drücken Sie weiter die 1X PBS, bis die Flüssigkeit erreicht die Auslassöffnung des Mikrofluidik-Gerät. Sobald die Lösung fließt aus der Steckdose, klemmen die Ablaufschlauch mit einem anderen Bindemittel Clip.
5. Drücken Sie weiter die 1 ml-Spritze, bis die 1X PBS fließt aus Einlaß 3, und klemmen Sie die Einlass-3-Port mit einem anderen Office-Sammelmappe Clip. Die Mikrofluidik-Gerät ist nun komplett grundiert.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Gerätes zeigt Einlässe für die jeweiligen Lösungen und Auslass.

2.3 Herstellung von Spritzenpumpen und Lösung

1. Zur Kalibrierung der Pumpen folgendermaßen vor:
   1. Für die große Harvard Spritzenpumpe (Harvard, PHD 22/2000 Part # 702000): Der Durchmesser Konfiguration bis 22,5 mm, Durchfluss 600 ul / min eingestellt.
   2. Für den kleinen Harvard Spritzenpumpe (Harvard, Pico Plus Part # 702213): Der Durchmesser Konfiguration auf 4,61 mm, Durchfluss Set 20 ml / min.
2. Füllen Sie eine 30 ml Spritze mit sterilem, deionisiertem Wasser. Dies kann durch die Rücknahme der Lösung direkt aus der 50 ml konischen Rohr durchgeführt werden. (Label der Spritze)
3. Füllen Sie ein zweites 30 ml Spritze mit 2X Phosphat-gepufferter-Saline (PBS), 2% Paraformaldehyd (PFA) unter Verwendung des Verfahrens in Schritt 9 beschrieben. (Label der Spritze)
4. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit 1X PBS aus der Aliquots in der 15 ml konische Röhrchen gelagert, wobei das Verfahren in Schritt 9 beschrieben.
5. Verbinden Sie die 30 ml VE-Wasser Spritze mit dem Einlass 2 und die 30 ml 2X PBS Spritze mit dem Einlass 3 (stellen Sie sicher, don t Trap Luftblasen im Schlauch oder Mikrofluidik-Gerät). Entfernen Sie die Klammer aus Buchten 2 und 3 und den Ablaufschlauch. Verbinden Sie den 1X PBS 1 ml-Spritze in den Einlaß 1. Vermeiden Sie die Einführung Blasen, indem die Nadel der Spritze mit Flüssigkeit, verbinden Sie die Spritze, und schnippte die Nadel der Spritze, um Blasen zu befreien.

2,4 Erythrozytenlyse

1. Stellen Sie alle der Spritzen auf dem richtigen Harvard Pumpen, wie unten beschrieben:
   1. Setzen Sie die zwei 30-ml-Spritzen (eine mit steriler, de-ionisiertes Wasser und das andere mit 2X PBS, 2% PFA) zusammen auf der großen Harvard Spritzenpumpe.
   2. Stellen Sie die 1 ml-Spritze (mit 1X PBS) auf der kleinen Harvard Spritzenpumpe.
   3. Setzen Sie den Ablaufschlauch in einem Abfallbehälter (50 ml konische Röhre, w beschriftet istaste).
2. Schalten Sie den großen Harvard Spritzenpumpe (mit 30 ml Spritzen) und lassen Sie ihn eine Minute lang laufen. (Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen und keine Leckage im Gerät oder in den Schlauch).
3. Schalten Sie den kleinen Harvard Spritzenpumpe und lassen Sie es für eine weitere Minute laufen. (Stellen Sie sicher, es gibt keine Blasen und keine Leckage im Gerät oder in den Schlauch). Stoppen Sie die Pumpen. Die Mikrofluidik-Gerät ist jetzt einsatzbereit.
4. Entfernen Sie den 1 ml-Spritze mit 1X PBS aus dem kleinen Harvard Spritzenpumpe.
5. Nach Abnahme der Blutprobe, füllen Sie die 1 ml Spritze mit 0,05 ml sterile 1X PBS ohne Einschluss von Luftblasen. Anschließend füllen Sie die Spritze mit 0,5 ml Blut aus dem Eppendorf-Röhrchen erhalten. (Die 1 ml-Spritze enthält nun ein Volumen von 0,55 ml Blut und 1X PBS-Puffer.) Hinweis: Halten Sie die Spritze senkrecht beim Ausfüllen zu vermeiden Vermischung der 0,05 ml PBS mit dem Blut.
6. Verbinden Sie die Spritze mit dem Blut zu Eingang 1 und montieren Sie die Spritze vorsichtig (zu vermeiden drängen das Blut durch den Schlauch in das Gerät) auf dem kleinen Harvard Spritzenpumpe (die Spritze montiert ist vertikal in die Pumpe).
7. Entfernen Sie den Ablaufschlauch aus dem Abfall Rohr und legte einen sauberen 50 ml Zentrifugenröhrchen an seinem Platz und stellte es auf einen Eimer mit Eis.
8. Schalten Sie das große Harvard Spritzenpumpe erste und lassen Sie es für 1 Minute laufen. Starten Sie das Sammeln der Probe aus der Steckdose in der 50 ml-Zentrifugenröhrchen.
9. Wechseln Sie auf die kleinen Harvard Spritzenpumpe.
10. Nachdem die Blutprobe in der 1 ml Spritze vollständig durch das Gerät gereist, stoppen beide Pumpen. Dies dauert etwa 20 Minuten.
11. Centrifuge die gesammelten Proben für 5 Minuten bei 350 xg bei Raumtemperatur mit der Bremse ausgeschaltet.
12. Entfernen Sie, indem Sie Pipettenspitze auf der gegenüberliegenden Seite des weißen Pellet Überstand. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, vor allem rote Zelltrümmer, ohne die weiße Pellet.
13. Resuspendieren der Probe in 1 ml Flow-Puffer (1X PBS, 1% BSA [Rinderserumalbumin], 2% PFA) durch Auf-und Abpipettieren. Transfer-Probe auf ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
14. Microcentrifuge die gesammelten Proben für 5 Minuten bei 4 xg bei Raumtemperatur. Verwenden derselben Präzision wie vor dem Überstand zu entfernen.
15. Resuspendieren der Probe in 1 ml Flow-Puffer durch Vortexen.

2.5 Herstellung für die durchflusszytometrische Analyse

1. Für die Probenanalyse mittels Durchflusszytometrie, 100 ul Probe zu einer Durchflusszytometrie Röhre.
2. Um die 100 ul Probe hinzuzufügen angegebenen Antikörper (die korrekte Konzentration).
3. Lassen Sie Probe für 30 Minuten bei 40 inkubieren C.
4. Zweimal waschen mit Durchfluss-Puffer vor der Durchflusszytometrie. Wash Schritt beinhaltet Zugabe von 250 ul der Strömung Puffer, vortexen, Zentrifugieren für 5 Minuten bei 350 xg und Entfernen mit einer Flüssigkeit wiederum der Durchflusszytometrie Rohr Überstand.
5. Das Pellet in 250 ul Puffer fließen. Die Probe wird zur Analyse bereit mittels Durchflusszytometrie.

Repräsentative Ergebnisse

Vollblut wurde durch die mikrofluidischen Lyse Gerät und Post-Processing-Protokoll ausgeführt wurde, befreien von Erythrozyten und bereichernd zirkulierenden Zellen mit Zellkern (CNCs). Ideal Ergebnisse liefern eine saubere Durchflusszytometrie Streudiagramm mit getrennten CNC Populationen. Unten in Abbildung 2 und 3 angezeigt werden Streudiagramm Vergleiche von einer Vollblut-Probe ohne Erythrozytenlyse und mit Erythrozyten-Lyse durch den mikrofluidischen Protokoll mit den Achsen als forward scatter (FSC) versus side scatter (SSC) Licht. Man erkennt, dass der mikrofluidischen Bereicherung Protokoll notwendig, um eine saubere Durchflusszytometrie Streudiagramm erhalten wird.

Abbildung 2. Durchflusszytometrie Streudiagramm Vollblutprobe ohne Erythrozytenlyse mit FSC-und SSC-Achsen.

Abbildung 3. Durchflusszytometrie Streudiagramm der zirkulierenden Zellen mit Zellkern mit mikrofluidischen Erythrozytenlyse von Populationen mit FSC-und SSC-Achsen beschriftet. Region 1 (rot) stellt Lymphozyten, Region 2 (grün) stellt Monozyten, Region 3 (blau) stellt Granulozyten und Region 4 (lila) ist noch nicht charakterisiert werden.

Entfernen von roten Zelltrümmern mit einer Pipette in das Protokoll ist auch wichtig, wenn nötig. Unten in Abbildung 4 ist ein Streudiagramm mit einem Überschuss von roten Zelltrümmern. Obwohl nicht trübt die Streudiagramm wie in Abbildung 2, muss man für den zusätzlichen Veranstaltungen durch Erythrozyten-Bruchstücken bei der Datenanalyse Konto.

Abbildung 4. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen roten Zelltrümmern, als Cluster zu sehender Ereignisse in Region 5 (cyan).

Färben von Zellen für bestimmte Antikörper Phänotyp Marker erzeugen auch charakteristische Ergebnisse. In den folgenden Figuren sind Antikörper Phänotyp Flecken für 3 verschiedene Leukozyten-Populationen: Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten. Abbildung 5 zeigt Lymphozytenpopulationen geplottet mit Äxten CD3 und CD4. Monozyten und Granulozyten sind in den Abbildungen 6-7 mit den Achsen als FSC gegen CD14 und CD66b gezeigt.

Abbildung 5. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Lymphozyten mit CD3-und CD4-Achsen.

Abbildung 6. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Monozyten mit FSC-und CD14-Achsen.

Abbildung 7. Durchflusszytometrie Streudiagramm darstellen Granulozyten mit FSC-und CD66b-Achsen.

Discussion

Ein automatisiertes mikrofluidischen Blut Lyse-Protokoll wurde berichtet. Im Rahmen des Protokolls sind wichtige Schritte erwähnenswert. In Abschnitt P.2.1, ist es wichtig, das erste Blut Fläschchen, da die Probe enthält verdrängt reife Endothelzellen als Fehlalarme gesammelt zu verwerfen. Stellen Sie außerdem sicher, dass die Blutprobe innerhalb einer Stunde nach Probenentnahme durchgeführt. Priming der mikrofluidischen Gerät in Abschnitt P.2.2, ist es wichtig, zunächst der Blasen zu befreien. Darüber hinaus sollte man vermeiden, die Einführung Blasen beim Anbringen neue Spritzen, um die Nadeln in das Protokoll. Beim Füllen der 1 ml Spritze mit Blut in Abschnitt P.2.4, muss man daran denken, fügen Sie zuerst 1X PBS und das Blut, die alle unter Beibehaltung der Spritze senkrecht zur Mischung der beiden Lösungen zu vermeiden. Vor Beginn der Spritzenpumpe Drücken der Blutprobe sicher, dass die große Spritze Pumpe läuft so ist das System bei voller Geschwindigkeit. Nachdem die Probe beendet ist durch das Gerät und wurde zentrifugiert, vorsichtig so viel Überstand wie möglich, einschließlich der roten Zelltrümmern, ohne die weiße Pellet. Schließlich, in Abschnitt P.2.5 des Herstellers folgen s-Protokoll auf die richtige Konzentration des Antikörpers zu gewährleisten ist es, die 100 ul Probe zugegeben.

Anwendungen der Mikrofluidik-Protokoll sind in der klinischen Forschung immens. Abfrage des Immunstatus eines einzelnen in Bezug auf CNCs wichtige Informationen generiert unter der Bedingung der Gesundheit und kann bei der Diagnose und das Verständnis der Pathogenese der Erkrankung zu helfen. Der Zugriff auf diese CNC Bevölkerung durch Blutentnahme ist einfacher und bequemer als menschlichen Ausdruck Analysen mit Tumorgewebe. Zur Untersuchung dieser kernhaltigen Zellen im Umlauf muss man in der Lage sein, die Populationen von anderen Blutbestandteilen einschließlich Erythrozyten, die primäre Funktion der gemeldeten Gerät zu bereichern. Daher würden solche Studien von großem Nutzen, der mikrofluidischen Blut Lyse-Protokoll.

Bedeutung der Mikrofluidik-Protokoll tritt in Bezug auf Anwendungen. Da kernhaltigen Zelle Bereicherung in klinischen Studien von Blut erforderlich ist, wird ein Protokoll benötigt wenig Know-how und Benutzer-vermittelten Schritte, die klare und konsistente Ergebnisse liefert wichtig. Die Mikrofluidik-Protokoll gewährleistet die Konsistenz durch Automatisierung und kontrollierte Exposition von Zellen gegenüber rauen Umgebungen. Mit Einheitlichkeit unter klinischen Labors Daten werden direkt vergleichbar [2].

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning
Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent	Dow Corning
30-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-301PL-25
Tygon tubing (.010" ID)	Small Parts, Inc.	TGY-010
20-gauge syringe needle	Small Parts, Inc.	NE-201PL-25
Syringe Pump (Harvard PHD 22/2000)	Harvard Apparatus	702000
Syringe Pump (Harvard Pico Plus)	Harvard Apparatus	702213
Flow cytometry tubes	DB Biosciences	352052
Antibody stains	DB Biosciences
1.5 ml Eppendorf tubes	Fisher Scientific	05-402-25
50 ml tube	Fisher Scientific
1 ml syringe	Fisher Scientific
30 ml tube	Fisher Scientific
Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific
Bovine serum albumin (BSA)	Fisher Scientific
10X PBS	Fisher Scientific