Nichtentkalktem Knochen Vorbereitung für Histologie, Histomorphometrisch und Fluorochrom Analysis

Zusammenfassung

Nichtentkalktem Knochenhistologie liefert wichtige Informationen für eine Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden.

Zusammenfassung

Nichtentkalktem Knochenhistologie zeigt die Mikroarchitektur des Knochens. Es zeigt sowohl die mineralisierten und zellulären Bestandteile des Knochens, die wichtige Informationen auf den Knochenumbau oder Knochenbildung und Resorption zur Verfügung stellt. Dies hat enorme Bedeutung in einer Vielzahl von klinischen und wissenschaftlichen Anwendungen. Es liefert schöne Bilder ¹ und ermöglicht Techniken wie Fluorochrom Beurteilung und Histomorphometrie ^2. Fluorochrom-Analyse ist eine Technik, bei der Fluoreszenz-Farbstoffe, die Kalzium binden zu einem bestimmten Zeitpunkt, der für die Quantifizierung der Menge der Mineralisierung können an diesem bestimmten Zeitpunkt gespritzt werden. Histomorphometrisch ist ein Prozess des Knochen-Quantifizierung auf der mikroskopischen Ebene.

Performing nichtentkalktem Knochenhistologie ist technisch anspruchsvoll, vor allem bei großformatigen Proben. Es erfordert Veränderungen in Technik von den in Standard-Paraffin eingebetteten Histologie verwendet. Dieses Video zeigt den Prozess der Herstellung guter Qualität Abschnitte und zeigt die technischen Schwierigkeiten und Methoden, mit denen sie zu überwinden. Probenvorbereitung, Fixierung und Verarbeitung sind mit einer ähnlichen Weise wie andere Weichteile, aber aufgrund der Dichte und eine geringere Durchlässigkeit des Knochens erheblich länger Fixierung und Verarbeitung gefordert sind, oft unter mehreren Wochen erreicht. Embedding erfolgt über ein Trägermedium mit ähnlichen oder gleichen Härte und Dichte des Knochens wie Methacrylat-Harze, aber im Gegensatz zu Paraffin Infiltration und Einbettung, ist dies ein irreversibler Schritt. Schnitte können durch Schleifen, die zu einer dickeren Abschnitt, der optimal für Studien wie Fluorochrom Analyse erreicht werden. Dies ist am besten mit einem Diamant-Trennscheibe auf einem macrotome. Alternativ können dünnere Abschnitte für die Lichtmikroskopie hergestellt werden und erreichen Sie dies über einen Schlitten Mikrotom mit einem sehr scharfen Messer. Der Schlitten Mikrotom bietet die zusätzliche Festigkeit und Stabilität für große, harte Blöcke benötigt. Resin eingebettet Abschnitte können mit einer Vielzahl von Flecken, die gezeigt gefärbt werden.

Protokoll

1. Das Gewebe wird in einem geschlossenen Behälter mit 10% Phosphat-gepufferter Formalin-Lösung ³ platziert. Stellen Sie sicher, minimal Einwirkung von Licht, wenn Fluorochrom-Analyse durchgeführt werden, da die Fluorochrome lichtempfindlich sind.
2. Stellen Sie die Ausrichtung des Gewebes erforderlich.
3. Schneiden Sie die Probe auf Größe, in der richtigen Ausrichtung, mit einer Bandsäge. Stellen Sie sicher, Sicherheitsmaßnahmen eingehalten werden. Die Probe wird dann in eine undurchsichtige Behälter gelegt, sollte das Volumen etwa das Zehnfache der Größe der Probe werden, um eine ausreichende Fixierung zu erreichen. Die Probe sollte in der Formalin-Lösung insgesamt zwischen einer und zwei Wochen, je nach ihrer Größe bleiben. Es wird empfohlen, mit Kontroll-Gewebe für die Prüfung und Optimierung.
4. Überprüfen Sie das Gewebe passt in die Einbettform und Ort des Gewebes in einem verschlossenen undurchsichtigen Behälter mit 70% Ethanol.
5. Prozess des Gewebes in aufsteigender Konzentrationen von Ethanol, Abschirmung vor Licht und unter ständigem Rühren.
   1. 70% Ethanol 1 Woche
   2. 80% Ethanol 1 Woche
   3. 90% Ethanol 1 Woche
   4. 100% Ethanol 1 Woche
6. Das Gewebe wird dann in Butanol für 1 Woche gelöscht, wieder Abschirmung von Licht und unter ständigem Rühren.
7. Die Dichte des Harzes und Knochen sollten eng aufeinander abgestimmt werden. Harzdichte verändert werden können (siehe Schritt 8), und wir empfehlen die Einbettung eines Prüflings erste richtige Dichte zu gewährleisten. Wir verwenden Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) für die Lichtmikroskopie und Fluorochrom-Analyse. Wenn Immunhistochemie ist erforderlich, eine alternative Harz muss wie Technovit 9100 (Heraeus Kulzer) verwendet werden.
8. Die Technovit 7100 Vorbereitung Lösung kann mit kleinen Aliquoten der Erweichung Lösung mit dem Kit enthalten sind, falls erforderlich vermischt werden, aber nicht mehr als 5% des Volumens der Zubereitung Lösung; nach unserer Erfahrung die Erweichung Lösung ist nur selten erforderlich. Zu gleichen Teilen absolutem Ethanol und Basisflüssigkeit Technovit 7100 werden gemischt und auf das Gewebe als pre-Infiltration Lösung für 24 Stunden minimiert Belichtung und unter Rühren.
9. Die Infiltration Lösung wird dann mit 1 g Härter I (= 1 Sack), die in 100 ml Basis Flüssigkeit gelöst wird. Dies ersetzt die vor Infiltration Lösung und darf für 1 Woche unter ständigem Rühren zu infiltrieren.
10. Legen Sie das Gewebe in die Form, mit der Schnittfläche nach unten zeigen. Stellen Sie sicher, es gibt einen Spielraum (im Idealfall mindestens 5 Millimeter) um das Gewebe für das Harz, das sorgt für Block Stärke. Mix 15mls von Technovit 7100 Vorbereitung Lösung mit 1 ml Härter II und gießen Sie rund um Probe in der Form und bedecken Sie es mit mindestens 5 millimietres. Die Aushärtung wird innerhalb von 2 Stunden zu beginnen, sondern wird komplett über Nacht.
11. Die Montage erfolgt dann durch Gestaltung einer Unterlage Block mit Technovit 3040 (Heraeus Kulzer) durchgeführt. Mix Technovit 3040 in einem Volumen-Verhältnis von 2 Teile Pulver zu 1 Teil Flüssigkeit zu einer viskosen Flüssigkeit erhalten. Gießen Technovit 3040 in die Aussparung an der Rückseite des Blocks auf ein Niveau von mindestens 2 mm über dem Boden des Blocks. Nach etwa 10 Minuten kann die Form abgeschält werden und der Block fertig ist.
12. Die Dichte und damit die Zerspanbarkeit von Methacrylatharz sind anfällig für die Luftfeuchtigkeit im Raum. Die Blöcke sollten daher in einem Exsikkator aufbewahrt werden.
13. Boden Schnitte produziert größere Abschnitte zwischen 20-50 Mikrometer dick. Es ist nützlich für Fluorochrom-Analyse (siehe unten) als dickere Abschnitte heller Fluoreszenz zu erzeugen. Sichern Sie die Diamantscheibe zu macrotome. Add Schmiermittel, wie Benzin, um das Reservoir auf dem macrotome. Sichern Sie den Block in der Klemme und orientieren sich an Klinge. Lassen Schleifen zu langsam erfolgen (ca. 20-30 Minuten pro Abschnitt) gewährleistet ausreichende Schmierung. Der erste Abschnitt macht die Spanfläche und richtet die Sektion-es sollte weggeworfen werden.
14. Im nächsten Abschnitt wird dann auf einen Superfrost Plus Objektträger gebracht. Der Abschnitt hat eine Tendenz, curl, damit wir platzieren einen Teil einer Sandwich-Beutel empfehlen darüber und dann hält sie flach mit einer anderen Folie eingespannt. Es wird dann in einen Inkubator zwischen 60-80 Grad Celsius für 1 Stunde gelegt. Dies mildert die Methacrylat und hilft dem Abschnitt, um die Folie in einer flachen Form zu halten.
15. Der Schliff kann gereinigt und poliert werden nach Bedarf mit feinem Schleifpapier auf sanfte Weise.
16. Der Schlitten Mikrotom Schnitte dünne Schnitte, welche die besten Abschnitte für Licht microsocopy. Verwenden Sie einen Schlitten Mikrotom wie Steifigkeit, die für das Schneiden von diesen harten Blöcken erforderlich ist hinzugefügt wurde. Alternativ kann eine angetrieben Rotationsmikrotom verwendet werden kann. Mit einem scharfen Klinge aus rostfreiem Stahl. Es ist besser, zwei Schaufeln zur Verfügung haben als eine wie das andere geschärft werden kann, verwendet wird. Die Klinge sollte einen Winkel von 45 Grad mit dem Block. Surface Erweichung kann durch Anlegen einer nassen Papier, um den Block bei Bedarf erreicht werden. Es kann mehrere Abschnitte, um die gewünschten Schnitt zu erzielen, um eine Qualität Abschnitt zu erhalten. Der Abschnitt wird dann auf ein Wasserbad schwimmen und auf eine Folie als in 16 oben.
17. Färbereagenzien sind in der Materialwirtschaft im Folgenden aufgeführt. Protokolle sind auf Bancroft ⁴ et al. Aufgrund Dickenvariation ist es empfehlenswert, Flecken auf Testdias optimieren. Rack-Färbung kann Gewebe zu schweben aus der Folie so Zugabe die Flecken direkt an einen Flachschieber kann erforderlich sein. Ein identisches Protokoll-oder Rack-Färbung ist notwendig für die konsequente Färbung Ergebnisse für Histomorphometrie erforderlich.
    1. Hämatoxylin und Eosin
       1. Stain mit Haematoxyilin 5-10 Minuten
       2. Sorgfältig mit Scott s Leitungswasser
       3. Stain mit Eosin 5 Minuten
       4. Wash in Leitungswasser
       5. In Xylol klären
       6. Montieren
       7. Ergebnisse
          1. Osteoid = pink
          2. Verkalkten Knochen = violett braun
          3. Zellkerne = blau
    2. Von Kossa
       1. Legen Sie in Silbernitrat-Lösung und setzen auf starke Licht bis mineralisierten Knochen schwarz wird (ca. 10 Min.)
       2. Wash in destilliertem Wasser dreimal
       3. Threat mit Natriumthiosulfat für 5 Minuten
       4. Wash in destilliertem Wasser
       5. Gegenfärbung mit Safrinin O
       6. In Xylol klären
       7. Montieren
       8. Ergebnisse
          1. Mineralisierte Knochen = schwarz
          2. Osteoid = rot / pink
    3. Masson Goldner s Trichrome
       1. Waschen mit alkalischen Alkohol (90mls von 80% Ethanol und 10mls von 25% Ammoniak für 20 Minuten)
       2. Spülen in Wasser
       3. Spülen in destilliertem Wasser
       4. Stain mit Weigert s Hämatoxylin für 10 Minuten
       5. Spülen in destilliertem Wasser
       6. Stain mit Ponceau-Fuchsin endgültige Lösung 5 Minuten
       7. Spülen mit 1% Essigsäure 15 Sekunden
       8. Stain in Phosphormolybdänsäure-Orange G Lösung 5 Minuten
       9. Spülen mit 1% Essigsäure 15 Sekunden
       10. Stain mit hellgrünen 5 Minuten
       11. Spülen mit 1% Essigsäure 3 ändert
       12. Spülen in destilliertem Wasser
       13. Montieren
       14. Ergebnisse
           1. Mineralisierte Knochen = grün
           2. Osteoid = rot / orange
           3. Zellkerne = blau grau
           4. Knorpel = violett
18. Fluorochrom Zubereitungen:
19. Diese werden durch langsame intravenöse Injektion verabreicht werden, mindestens zwei Wochen auseinander.
20. Dosen
    1. Calcein Grün 10 mg / kg IV
    2. Oxytetracyclin 50 mg / kg IV
    3. Alizarin-Komplexon 30 mg / kg IV
21. Vorbereitung von Calcein Grün
    1. Ein Gramm des Calcein Grün ist mit 1 M NaOH titriert, bis aufgelöst.
    2. pH wird mit 1% NaOH bis pH = 7,1-7,2 eingestellt.
    3. Filter und halten abgeschirmt vom Licht
22. Vorbereitung der Alizarin-Komplexon
    1. Drei Gramm Alizarin-Komplexon wird mit 1 M NaOH titriert, bis aufgelöst.
    2. pH-Wert liegt dann mit 1% HCl oder NaOH bis pH = 7,1-7,2 eingestellt.
    3. Filter und halten abgeschirmt vom Licht
23. Vorbereitung von Oxytetracyclin
    1. Oxytetracyclin ist als aus dem Regal anti-mikrobiellen Medikamenten. Keine Vorbereitung erforderlich.

Materialien

a) Hämatoxilin Lösung
Hämatoxilin	1g
Absoluter Alkohol	100ml
b) Eisen-Lösung
30% ige wässrige Eisenchlorid	4mL
Salzsäure (konzentriert)	1ml
destilliertem Wasser	95ml

a) Ponceau de Xylidin Lösung
Ponceau de Xylidin	0.75g
Säure fuchsion	0.25g
Essigsäure	1ml
mischen, und fügen Sie destilliertes Wasser (100 ml)
b) azophloxin Lösung
Azophloxin	0.5g
Essigsäure	0,6 ml
mischen, und fügen Sie destilliertes Wasser (100 ml)
c) Letzter Arbeitstag Färbelösung
Ponceau-Fuchsin-Lösung	5-10ml
Azophloxin	2 ml
0,2% Essigsäure-Lösung	88ml

Light Green	1g
Essigsäure	1ml
Mix, und fügen Sie destilliertes Wasser (500 ml)

Phosphormolybdänsäure	3g
Orange G	2g
Man löst in 500 ml destilliertem Wasser und fügen Kristall Thymol.

1% ige wässrige Silbernitratlösung

2,5% Natriumthiosulfat

1% Safranin O

Alcianblau 8GX	1g
3% Essigsäure-Lösung	100ml

a) Harris Hämatoxilin
Hämatoxilin	2.5g
Absolute Alkohol	25ml
Potassium Alum	50g
destilliertem Wasser	500ml
Quecksilberoxid	1,25 g OR
Natriumjodat	0.5g
Eisessig	20mL
b) Eosin-Lösung
Kommerziell hergestellte Eosin verwendet wurde.

Hersteller	Fluorochrom	Katalog-Nummer
Sigma-Aldrich, Sydney	Calcein Grün	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarin-Komplexon	A3882
Intervet Australia, Victoria	Oxytetracyclin (Aus dem Regal antimikrobiellen Wirkstoff)	Handelsname; Engemycin 100