Methodenartikel

Mosaic Zebrafisch Transgenese zur Beurteilung Enhancer-Sequenzen

DOI:

10.3791/1722

⸱

16. Juli 2010

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir zeigen unseren Ansatz zur Suche nach potenziellen Enhancer-Elemente aus entwicklungsmäßig regulierten Genen und der Bewertung ihrer Funktion durch Mosaik Zebrafisch Transgenese.

Zusammenfassung

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Die Fertigstellung des menschlichen Genoms, zusammen mit dem vieler anderer Arten, hat die Herausforderung zuzuschreiben bestimmte Funktion nicht kodierende Sequenzen hervorgehoben. Ein prominenter Funktion von den nicht codierenden Teil des Genoms ist es, Gentranskription regulieren, jedoch gibt es keine wirksamen Methoden, um im Großen und Ganzen vorherzusagen cis-regulatorische Elemente aus primären DNA-Sequenz. Wir haben ein effizientes Protokoll entwickelt, um funktionell zu bewerten potentielle cis-regulatorische Elemente durch Zebrafisch Transgenese. Unser Ansatz bietet erhebliche Vorteile gegenüber Zellkultur-Techniken für entwicklungspolitisch wichtige Gene, da sie Informationen über die räumliche und zeitliche Genregulation bietet. Umgekehrt ist es schneller und kostengünstiger als vergleichbare Experimente in transgenen Mäusen, und wir routinemäßig anwenden, um Sequenzen aus dem menschlichen Genom isoliert. Hier zeigen wir unseren Ansatz zur Auswahl von Elementen für die Prüfung auf der Grundlage Folge Erhaltung und unser Protokoll für das Klonen Sequenzen und Mikroinjektion sie in Zebrafisch-Embryonen.

Protokoll

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1. Auswahl und das Klonen von konservierten Sequenzen für die Prüfung

  1. Man muss zuerst potenzielle regulatorische Sequenzen für Funktionstests. Wir verlassen uns auf evolutionäre Sequenzanalyse Erhaltung als Kriterium, um Sequenzen zu wählen, und am häufigsten verwenden den Algorithmus PhastCons, die zugänglich wie ein Track auf der UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway) ist. Es gibt jedoch viele andere Algorithmen zur Verfügung Sequenzkonservierung über Artgrenzen zu bewerten.
  2. Sobald wir unsere ausgewählten Sequenzen gestalten wir Primer an jeder Sequenz aus genomischer DNA zu amplifizieren. Primer so gewählt werden, die k....

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Diskussion

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Wir haben den Ansatz in unserem Labor für die effiziente Analyse potentieller Enhancer mit Zebrafisch Transgenese verwendet demonstriert. Meistens benutzen wir diesen Ansatz für Gewebe-spezifische Enhancer mit menschlichen Genen assoziiert zu suchen. Trotz des Fehlens von klar Sequenzhomologie die meiste Zeit zwischen Mensch und Fisch nicht-kodierenden Sequenzen, finden wir, dass dieser Ansatz ist in der Regel bei der Identifizierung von Mitteln für die Gene von Interesse, um uns erfolgreich. Die kritischen Faktoren für.......

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Danksagungen

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Wir danken Frau Paula Roy für exzellente Fisch Tierhaltung und Steve Ekker für die Art Geschenk der pDB600 Plasmid. Diese Studien wurden durch einen Zuschuss zur SF aus NHGRI finanziert.

....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Takara LA TaqTakara Bio IncRR02M
pCR8/GW/TOPO TA KlonierungskitInvitrogenK2500-20
Gateway LR Clonase II EnzymmixInvitrogen11791-100
Bibliothekseffizienz kompetente Zellen DH5αInvitrogen12535-019
Kompetente Zellen für die Bibliothekseffizienz DB3.1Invitrogen11782-018
mMESSAGE mMACHINE KitAmbionAM1340
HiSpeed Plasmid Midi KitQiagen12643
QIAquick PCR Aufreinigungskit Qiagen28104
/braune Mikropipette AbzieherSutter Instrument Ko.P-97
Pneumatische PicoPumpWorld Precision Instruments, Inc.SYS-PV820
Flammende

Referenzen

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  1. Fisher, S. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 1 (3), 1297-12 (2006).
  2. Balciunas, D. Harnessing a high cargo-capacity transposon for ....

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Schlagwörter

Microinjection ProtocolSequence ConservationTransposase EnzymeEmbryo InjectionGFP ExpressionTissue SpecificitySkeletal DevelopmentCis Regulatory Elements

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