Die Autoren haben nichts offenzulegen.

christopher hughes: eine in-vitro-modell für das studium der angiogenese (interview)

Christopher CW Hughes beschreibt den Nutzen von seiner Kultur für die Untersuchung der Angiogenese in vitro. Er erklärt die Bedeutung der Fibroblasten, die eine kritische, bisher nicht identifizierten löslichen Faktor, der Endothelzellen auf Schiffe in Kultur bilden können, die Filiale, bilden richtige Lumen, und unterziehen Anastomose absondern.

Christopher Hughes: Eine In-vitro-Modell für das Studium der Angiogenese (Interview)

Christopher C.W. Hughes describes the utility of his culture system for studying angiogenesis in vitro.  He explains the importance of fibroblasts that ...

Hallo, mein Name ist Dr. Christopher Hughes. Ich bin Professor an der University of California Irvine und mein Labor beschäftigt sich mit Angiogenese. Und wir interessieren uns besonders für die Gene, die den Prozess der Angiogenese regulieren.Wir haben einen In-vitro-Assay auf der Grundlage der Arbeit von Nelson optimiert, und in diesem Assay können wir uns all die verschiedenen Prozesse ansehen, die während der Angiogenese ablaufen, beschichten wir Tedex-Kügelchen, kleine Kügelchen mit Endothelzellen. Dann betten wir diese in Fibringele ein. Wir liefern Wachstumsfaktoren.Und im Laufe mehrerer Tage sprießen die Endothelzellen aus den Kügelchen. Sie wandern, sie richten sich aus, sie vermehren sich, sie bilden Röhren, sie verzweigen sich und sie bilden eine Anastomose. So dass wir nach etwa 10 Tagen ein vollständiges kapillarartiges Netzwerk in Kultur haben.Nun, einige der Probleme mit Envivo- und Angiogenese-Assays, zum Beispiel, die an Mäusen durchgeführt werden, sind, dass es nicht sehr einfach ist, das System zu manipulieren. Es ist schwer vorstellbar, wenn man das in einem Tier vor sich hat, man kann nicht wirklich sehen, wie die Angiogenese stattfindet. Und wenn man das System in unseren In-vitro-Kulturen manipulieren will, ist es sehr einfach, die Endothelzellen genetisch zu manipulieren, Gene ein- und auszuschalten und sich die Auswirkungen davon auf die sprießende Angiogenese anzusehen.Und es ist viel schwieriger, das beim ganzen Tier zu tun. Du musst Knockouts oder Knockins machen. Das sind also die beiden großen Vorteile.Es ist leicht zu manipulieren und es ist leicht zu visualisieren. Im Laufe der Jahre wurden eine Reihe verschiedener in vitro Agenesie-Assays entwickelt, die alle ihre Vor- und Nachteile haben. Und ein besonders bekannter ist der Matrix-Gel-Assay, bei dem Endothelzellen auf diese extrazelluläre Matrix, das Matrigel, gelegt werden.Und das Problem dabei ist, dass die Endothelzellen strangartige Strukturen bilden, aber sie bilden nie wirklich richtige aluminisierte Gefäße. Man sieht kein Keimen, man sieht keine Anastomose. Es gibt Kollagen-Gel-Modelle, die gut sein können.Es gibt viele von denen, von denen Sie keine Proliferation der Endothelzellen sehen. Sie neigen nicht dazu, eine Anastomose zu sehen. Der Fibringel-Assay, den wir entwickelt haben, basiert auf einem Modell von Nelson Kar, das Mitte der neunziger Jahre veröffentlicht wurde.Und wir haben das jetzt dramatisch verbessert, so dass wir alle Stadien der Angiogenese sehen können. Wir können das anfängliche Keimen, die Migration beobachten. Wir sehen die Proliferation von Zellen, wir sehen die Bildung von Lumen, wir bekommen Verzweigungen und schließlich bekommen wir eine Anastomose, um ein vollständiges Gefäßnetzwerk in vitro zu bilden.Wir glauben also, dass dieser Assay wirklich das beste In-vitro-System ist, wenn man sich all diese verschiedenen Stadien der Angiogenese ansehen möchte. Ein weiterer Vorteil, den wir mit diesem In-vitro-Assay haben, ist, dass wir Laser-Capture und Mikrodissektion durchführen können, wir können die Kultur so herunterdrehen, dass sie sehr flach wird, und dann das Laser-Capture-Mikrodissektionsmikroskop verwenden. Wir können tatsächlich einzelne Zellen herausnehmen, und wir interessieren uns insbesondere für die Spitzenzellen.Und so schneiden wir diese heraus und können uns die Genexpression ansehen, insbesondere in den Spitzenzellen im Vergleich zu den Stammzellen, den Zellen, die tatsächlich das Lumen bilden. Und unsere Hypothese ist, dass es eine unterschiedliche Genexpression zwischen diesen beiden Zellpopulationen geben wird. Wir können uns das ansehen, es wäre so gut wie unmöglich, das in einem In-vivo-System zu tun.Wir glauben also, dass dies ein weiterer großer Vorteil der Verwendung dieses In-vitro-Assays ist. Die frühen Arbeiten, die in diesem Bereich geleistet wurden, wurden, wie ich von Nelson Recon erwähnt habe, mikrovaskuläre Endothelzellen verwendet. Und es wird viel darüber nachgedacht, dass mikrovaskuläre Endothelzellen, die Zellen, die man für einen solchen Assay verwenden möchte, denn in vivo ist es das mikrovaskuläre EC, das wirklich neue Gefäße bildet.Wir haben uns entschieden, dies mit ve zu versuchen. Dies sind aus mehreren Gründen menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene. Eine davon ist, dass diese Zellen sehr einfach zu gewinnen sind.Sie können ins Krankenhaus gehen, Sie können Nabelschnüre aus den Kreißsälen holen und Sie können die Zellen sehr einfach isolieren. Und auch diese Zellen werden seit vielen Jahren in Kultur verwendet. Sie sind sehr gut charakterisiert.Und so haben wir diesen Assay eingerichtet und optimiert, so dass wir diese Zellen für diese Zwecke verwenden konnten. Und interessanterweise stellt sich heraus, dass vex, diese großen Gefäßendothelzellen, die Form von mikrovaskulären Endothelzellen und Kulturen anzunehmen scheinen. Sie verlieren viele Gene, die normalerweise von großen Gefäß-EC exprimiert werden, und sie beginnen, Gene zu exprimieren, die normalerweise mit mikrovaskulären Endothelzellen assoziiert sind.Und sie sind durchaus in der Lage, kapillarartige Sprossen zu bilden, Lumen zu bilden und das, was auf der ganzen Welt aussieht, wie echte Kapillaren in der Kultur aussehen zu lassen. Sie sind also einfach zu bedienen, wir sind einfach zu bedienen und sie tun, was wir von ihnen erwarten. Sie sprießen und bilden richtige aluminisierte Gefäße.Wenn wir diesen Assay quantifizieren wollen, gibt es wirklich mehrere Möglichkeiten, die wir gehen können. Wir können uns wirklich quantitative Kriterien ansehen, wie die Anzahl der Sprossen, die Länge der Sprossen, den Durchmesser der Sprossen, die Anzahl der Verzweigungspunkte, die Anzahl der Anastomose, aber wir schauen uns auch qualitative Kriterien an. Und so können wir uns ansehen, ob sie Lumen bilden?Und das ist wahrscheinlich das, was uns am meisten interessiert. Bei vielen der Assays, die wir durchführen, ist die richtige Lumenbildung. Und das ist wirklich eher eine qualitative Bewertung, obwohl man, wenn die Gefäße größer werden, tatsächlich auch den Durchmesser dieser Lumen messen kann.Also verwenden wir Fibroblasten In diesen Kulturen. Wir betten die Kügelchen in das Fibringel ein und plattieren Fibroblasten auf das Gel. Die Fibroblasten sind für das richtige Keimen und die Lumenbildung absolut unerlässlich.In Abwesenheit von Fibroblasten keimen wir. Die Endothelzellen neigen jedoch dazu, nicht aneinander gebunden zu bleiben. Was passiert, ist, dass sie sich voneinander entfernen.Und so neigt jede Struktur, die Du auf diesem Spross entwickelst, dazu, auseinanderzufallen. Und nach ein paar Tagen durchlaufen die Endothelzellen eine Apoptose. Es sieht also so aus, als ob Fibroblasten einen Faktor herstellen, der für die Angiogenese essentiell ist, zumindest in diesem in vitro System.Und wir waren sehr daran interessiert zu wissen, was diese Faktoren sind. Was wir herausgefunden haben, ist, dass die Fibroblasten etwas in das Medium absondern, so dass wir den Fibroblasten Bedingungsmedium entnehmen können, das das richtige Keimen und die Lumenbildung unterstützt. Wir haben es also definitiv mit einem lösbaren Faktor zu tun.Offensichtlich sind wir sehr daran interessiert zu wissen, was die Fibroblasten produzieren, was für die Angiogenese in diesem System so wichtig ist. Wir haben alle üblichen Verdächtigen ausprobiert, VEGF, basisches fg F sind, sind in der Kultur, die Zugabe von mehr ersetzt keine Fibroblasten. Wir haben auch Angiopoietin eins, TGF beta, H, GF und so weiter ausprobiert.Bisher haben wir den entscheidenden Faktor nicht gefunden. Was wir jetzt also tun, ist, Faktoren aus dem Zustandsmedium von Fibroblasten zu reinigen. Wir setzen also die Bedingung medium über verschiedene Spalten, Kationen, Austausch, Größenausschluss, und wir erhalten Bruchteile davon, die Aktivität haben.Und wir verfolgen jetzt diese Aktivität und wir nehmen diese Fraktionen, finden heraus, welche aktiv sind, und von dort aus können wir diese auf Gelen laufen lassen, um sicherzustellen, dass wir nur eine relativ kleine Anzahl von Banden auf dem Gel haben, und dann können wir diese herausschneiden und sie nach Massenspektrometrie sequenzieren lassen. Und, und das beschert uns viele interessante Tage. Wir haben jetzt eine ganze Reihe von Kandidatengenen, die wir einzeln testen, um zu sehen, ob sie tatsächlich der Faktor sind, den wir suchen.Wir haben also viele bekannte angiogene Faktoren getestet und wir wissen, dass veg GF und basisches FGF tatsächlich essentiell sind, für das richtige Keimen in diesem Assay. Aber sie sind nicht die ganze Geschichte. Es gibt abgeleitete Faktoren, die, wie ich bereits erwähnt habe, und eine Möglichkeit, wie wir dies betrachtet haben, darin besteht, dass wir Tumorzellen genommen haben, die in vivo stark angiogen sind, sie erzeugen große Tumore in Mäusen und sie sind stark vaskularisiert.Und wir haben uns diese Tumorzellen angesehen und sie exprimieren sehr hohe Mengen an VEGF, und wir haben diese in unsere Kulturen gegeben. Wir haben also die Fibroblasten durch diese Tumorzellen ersetzt, und sie unterstützen in diesem Assay keine robuste Angiogenese. Und das, das ist sehr interessant.Das deutet darauf hin, und das wurde auch von anderen Leuten vorgeschlagen, dass es eine Wechselwirkung zwischen dem Tumor, dem S-Stroma, den Fibroblasten und anderen Stützzellen im Gewebe und den Endothelzellen gibt. Und es kann gut sein, dass die Tumorzellen einige Faktoren produzieren, die direkt auf die Endothelzellen wirken, aber sie produzieren auch andere, die die Fibroblasten und andere Stromazellen stimulieren, um Faktoren zu bilden, die dann auch eine robuste Angiogenese unterstützen.

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Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

University of California, Irvine (UCI).  Christopher CW Hughes beschreibt den Nutzen von seiner Kultur für die Untersuchung der Angiogenese in vitro. Er erklärt die Bedeutung der Fibroblasten, die eine kritische, bisher nicht identifizierten löslichen Faktor, der Endothelzellen auf Schiffe in Kultur bilden können, die Filiale, bilden richtige Lumen, und unterziehen Anastomose absondern.

Christopher Hughes: Eine In-vitro-Modell für das Studium der Angiogenese (Interview)

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