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christopher hughes: eine in-vitro-modell für das studium der angiogenese (interview)

Christopher Hughes:  An in vitro model for the Study of Angiogenesis (Interview)

Christopher CW Hughes beschreibt den Nutzen von seiner Kultur für die Untersuchung der Angiogenese in vitro. Er erklärt die Bedeutung der Fibroblasten, die eine kritische, bisher nicht identifizierten löslichen Faktor, der Endothelzellen auf Schiffe in Kultur bilden können, die Filiale, bilden richtige Lumen, und unterziehen Anastomose absondern.

Christopher Hughes: Eine In-vitro-Modell für das Studium der Angiogenese (Interview)

Christopher C.W. Hughes beschreibt die Nützlichkeit seines Kultursystems zur Untersuchung der In-vitro-Angiogenese. Er erläutert die Bedeutung von Fibroblasten, die ...

Hi, mein Name ist Dr. Christopher Hughes. Ich bin Professor an der University of California Irvine, und mein Labor beschäftigt sich mit Angiogenese. Insbesondere interessieren wir uns für die Gene, die den Prozess der Angiogenese regulieren.Wir haben einen In-vitro-Test basierend auf der Arbeit von Nelson optimiert, und in diesem Test können wir alle unterschiedlichen Prozesse untersuchen, die während der Angiogenese ablaufen. Wir beschichten Teflonkugeln, kleine Kugeln, mit endothelialen Zellen. Anschließend geben wir diese in Fibringele ein. Wir geben Wachstumsfaktoren hinzu.Über mehrere Tage hinweg sprossen die Endothelzellen von den Kügelchen aus. Sie wandern, richten sich aus, proliferieren, bilden Röhren, verzweigen sich und schließen Anastomosen. So entsteht innerhalb von etwa 10 Tagen eine vollständige, kapillarähnliche Netzwerkstruktur in der Kultur.Nun, einige der Probleme bei In-vivo- und Angiogenese-Assays, beispielsweise solchen, die an Mäusen durchgeführt werden, bestehen darin, dass es viel schwieriger ist, das System zu manipulieren. Es ist schwer vorstellbar, was innerhalb eines Tieres geschieht; man kann die Angiogenese tatsächlich nicht direkt beobachten. Wenn man das System jedoch in unseren In-vitro-Kulturen manipulieren möchte, ist es sehr einfach, die Endothelzellen genetisch zu verändern, Gene gezielt ein- oder auszuschalten und die Auswirkungen darauf auf die sprossende Angiogenese zu untersuchen.Und das ist beim gesamten Tier viel schwieriger. Man muss Knockouts oder Knockins erzeugen. Das sind also die beiden wesentlichen Vorteile.Es ist leicht zu manipulieren und leicht zu visualisieren. Im Laufe der Jahre wurden daher eine Reihe verschiedener in-vitro-Angiogenese-Assays entwickelt, die jeweils ihre Vor- und Nachteile haben. Ein besonders bekannter ist der Matrix-Gel-Assay, bei dem Endothelzellen auf eine extrazelluläre Matrix namens Matrigel gegeben werden.Und das Problem dabei ist, dass die Endothelzellen strukturgebende, strangartige Gebilde bilden, aber niemals wirklich ordnungsgemäße luminierte Gefäße ausbilden. Man beobachtet kein Aussprossen, keine Anastomosen. Es gibt Kollagen-Gel-Modelle, die durchaus geeignet sein können.Es gibt viele davon, bei denen Sie keine Proliferation der Endothelzellen sehen. Sie neigen auch nicht dazu, eine Anastomose zu beobachten. Der von uns entwickelte Fibrin-Gel-Assay basiert auf einem Modell von Nelson Kar, das Mitte der neunziger Jahre veröffentlicht wurde.Und wir haben dies nun erheblich verbessert, sodass wir alle Stadien der Angiogenese beobachten können. Wir können das ursprüngliche Aussprossen und die Zellwanderung verfolgen. Wir sehen die Proliferation der Zellen, die Lumenbildung, es kommt zu Verzweigungen, und schließlich erfolgt die Anastomose, wodurch ein vollständiges vaskuläres Netzwerk in vitro entsteht.Daher ist dieses Assay, wie wir glauben, das beste in-vitro-System, das derzeit verfügbar ist, wenn man alle verschiedenen Stadien der Angiogenese untersuchen möchte. Ein weiterer Vorteil dieses in-vitro-Assays besteht darin, dass wir eine Lasermikrodissektion durchführen können, indem wir die Kultur abzentrifugieren, sodass sie sehr flach wird, und anschließend das Lasermikrodissektionsmikroskop verwenden. Wir können tatsächlich einzelne Zellen isolieren, wobei wir uns insbesondere für die Spitzenzellen interessieren.Und so schneiden wir diese aus und können die Genexpression untersuchen, insbesondere in den Spitzenzellen im Vergleich zu den Rumpfzellen, also den Zellen, die tatsächlich das Lumen bilden. Unsere Hypothese lautet, dass es eine differentielle Genexpression zwischen diesen beiden Zellpopulationen geben wird. Wir können dies untersuchen, was in einem In-vivo-System praktisch unmöglich wäre.Daher halten wir dies für einen weiteren großen Vorteil der Verwendung dieses In-vitro-Assays. Die frühen Arbeiten dazu, wie ich bereits von Nelson Recon erwähnt habe, verwendeten mikrovaskuläre endotheliale Zellen. Und es wird allgemein angenommen, dass mikrovaskuläre endotheliale Zellen diejenigen Zellen sind, die man für einen solchen Assay verwenden sollte, da in vivo die mikrovaskulären EZ tatsächlich neue Gefäße bilden.Wir haben beschlossen, dies mit ve zu versuchen. Dies sind humane Endothelzellen aus Nabelvenen, und zwar aus mehreren Gründen. Einer davon ist, dass diese Zellen sehr leicht zu beschaffen sind.Sie können ins Krankenhaus gehen, Nabelschnüre aus den Entbindungsräumen erhalten und die Zellen sehr leicht isolieren. Außerdem werden diese Zellen bereits seit vielen Jahren in der Kultur verwendet. Sie sind sehr gut charakterisiert.Und so haben wir diesen Assay eingerichtet und optimiert, um diese Zellen aus den genannten Gründen verwenden zu können. Interessanterweise stellt sich heraus, dass Vex, diese Endothelzellen großer Gefäße, im Kulturmedium die Form von mikrovaskulären Endothelzellen annehmen. Sie verlieren viele Gene, die normalerweise von Endothelzellen großer Gefäße exprimiert werden, und beginnen, Gene zu exprimieren, die normalerweise mit mikrovaskulären Endothelzellen assoziiert sind.Und sie sind durchaus in der Lage, kapillarähnliche Auswüchse zu bilden, Lumen auszubilden und in der Kultur etwas hervorzubringen, das in der ganzen Welt wie echte Kapillaren aussieht. Sie sind also einfach zu handhaben, ve sind einfach zu handhaben, und sie tun, was wir von ihnen erwarten. Sie bilden Auswüchse und erzeugen ordnungsgemäß luminierte Gefäße.Wenn wir diesen Assay quantifizieren möchten, gibt es tatsächlich mehrere Möglichkeiten. Wir können quantitative Kriterien wie die Anzahl der Auswüchse, die Länge der Auswüchse, den Durchmesser der Auswüchse, die Anzahl der Verzweigungsstellen und die Anzahl der Anastomosen betrachten, aber wir berücksichtigen auch qualitative Kriterien. So können wir beispielsweise untersuchen, ob sie Lumina bilden.Und das ist vermutlich tatsächlich das, was uns am meisten interessiert. Bei vielen der von uns durchgeführten Assays geht es um die korrekte Lumenbildung. Das ist tatsächlich eher eine qualitative Beurteilung, obwohl man bei größeren Gefäßen auch den Durchmesser dieser Lumina tatsächlich messen kann.Daher verwenden wir in diesen Kulturen Fibroblasten. Wir betten die Kügelchen in das Fibrin-Gel ein und säen Fibroblasten auf der Oberseite des Gels aus. Die Fibroblasten sind absolut essentiell für eine ordnungsgemäße Ausbildung von Ausstülpungen und Lumina.Bei Abwesenheit von Fibroblasten beobachten wir ein gewisses Auswachsen. Allerdings neigen die endothelialen Zellen dazu, nicht miteinander verbunden zu bleiben. Stattdessen wandern sie voneinander weg.Und so zerfällt jede Struktur, die Sie an diesem Spross entwickeln, leicht. Nach einigen Tagen gehen die endothelialen Zellen in den programmierten Zelltod (Apoptose). Es scheint also, dass Fibroblasten Faktoren produzieren, die für die Angiogenese zumindest in diesem In-vitro-System unerlässlich sind.Und wir interessieren uns sehr dafür, welche diese Faktoren sind. Wir haben festgestellt, dass die Fibroblasten etwas in das Medium absondern, sodass wir konditioniertes Medium von den Fibroblasten entnehmen können, das dann ein ordnungsgemäßes Aussprossen und die Lumenbildung unterstützt. Wir haben es also eindeutig mit einem löslichen Faktor zu tun.Es ist daher offensichtlich, dass wir sehr daran interessiert sind herauszufinden, was die Fibroblasten in diesem System produzieren, das für die Angiogenese so wichtig ist. Wir haben alle üblichen Verdächtigen getestet: VEGF, basisches fg F ist in der Kultur vorhanden, eine zusätzliche Zugabe ersetzt jedoch nicht die Fibroblasten. Außerdem haben wir Angiopoietin 1, TGF-beta, H, GF usw. usw. versucht.Bisher haben wir den entscheidenden Faktor noch nicht gefunden. Deshalb reinigen wir derzeit Faktoren aus dem konditionierten Medium von Fibroblasten. Dazu leiten wir das konditionierte Medium über verschiedene Säulen, wie Kationenaustausch- und Größenausschluss-Säulen, und erhalten Fraktionen, die Aktivität aufweisen.Und wir verfolgen diese Aktivität nun, nehmen diese Fraktionen, identifizieren, welche aktiv sind, und können anschließend diese im Gel laufen lassen, um sicherzustellen, dass nur relativ wenige Bande im Gel sichtbar sind. Danach können wir diese ausschneiden und durch Massenspektrometrie sequenzieren lassen. Das bereitet uns viele sehr interessante Tage. Mittlerweile haben wir bereits eine beträchtliche Anzahl an Kandidatengenen, die wir einzeln testen, um zu prüfen, ob sie tatsächlich der gesuchte Faktor sind.Wir haben daher viele bekannte angiogenetische Faktoren getestet und wissen nun, dass VEGF und basisches FGF für das korrekte Auswachsen in diesem Assay tatsächlich unerlässlich sind. Doch sie erklären nicht alles. Es gibt abgeleitete Faktoren, die wichtig sind, wie ich bereits erwähnt habe, und eine Möglichkeit, dies zu untersuchen, bestand darin, Tumorzellen zu verwenden, die in vivo stark angiogenetisch wirken, bei Mäusen große Tumore bilden und stark vascularisiert sind.Und wir haben diese Tumorzellen untersucht, und sie exprimieren sehr hohe Mengen an VEGF, die wir in unsere Kulturen eingebracht haben. Wir haben also die Fibroblasten durch diese Tumorzellen ersetzt, und sie unterstützen in diesem Assay keine robuste Angiogenese. Und das ist sehr interessant.Das deutet darauf hin – und dies wurde auch bereits von anderen Forschern vorgeschlagen –, dass eine Wechselwirkung zwischen dem Tumor, dem Stroma, das aus Fibroblasten und anderen Stützzellen im Gewebe besteht, und den endothelialen Zellen besteht. Möglicherweise produzieren Tumorzellen einige Faktoren, die direkt auf die endothelialen Zellen wirken, aber sie setzen auch andere Faktoren frei, die Fibroblasten und weitere stromale Zellen stimulieren, ihrerseits solche Faktoren zu bilden, die anschließend eine starke Angiogenese unterstützen.

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University of California, Irvine (UCI).  Christopher CW Hughes beschreibt den Nutzen von seiner Kultur für die Untersuchung der Angiogenese in vitro. Er erklärt die Bedeutung der Fibroblasten, die eine kritische, bisher nicht identifizierten löslichen Faktor, der Endothelzellen auf Schiffe in Kultur bilden können, die Filiale, bilden richtige Lumen, und unterziehen Anastomose absondern.

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