Dieses Video zeigt eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Dissoziiert kommissuralen Neuronen sind nützlich, um die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon-Wachstum und Anleitung zu studieren.
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Methodenartikel
Dissection und Kultur kommissuralen Nervenzellen aus embryonalen Rückenmark
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Kommissuralen Neuronen wurden häufig verwendet, um die zugrunde liegenden Mechanismen Axon Führung während der embryonalen Entwicklung des Rückenmarks zu untersuchen. Die Zellkörper dieser Neurone sind in der dorsalen Rückenmark und ihre Axone folgen stereotype Trajektorien während der embryonalen Entwicklung. Kommissuralen Axone zunächst ventral Projekt auf die Bodenplatte. Nach dem Überqueren der Mittellinie, diese Axone anterior und Projekt in Richtung des Gehirns. Jeder dieser Schritte wird durch die Wirkung von mehreren Führung Cues geregelt. Kulturen stark in kommissuralen Neuronen angereichert sind ideal für viele Experimente Bewältigung der Mechanismen der Axon Wegfindung, einschließlich Drehen Assays, Immunchemie und Biochemie geeignet. Hier beschreiben wir eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus E13 Ratte Rückenmark. Zuerst wird das Rückenmark isoliert und dorsalen Streifen sind herauspräpariert. Die dorsale Gewebe wird dann in eine Zellsuspension durch Trypsinierung und mechanische Störungen dissoziiert. Neuronen sind auf Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläschen oder Gewebe-Kulturschalen plattiert. Nach 30 Stunden
Protokoll
1. Dissection der embryonalen Ratte Rückenmark
Allgemeine Empfehlungen
Keep L-15-Medium auf Eis und ändern sich häufig das Medium, in dem Sezieren Gericht zu halten Embryonen cool. Dies schont Gewebe Integrität. Alle Schritte werden mit zwei Paaren von Dumont Nr. 5 Pinzette durchgeführt sofern nicht anders angegeben. Um Verunreinigungen zu vermeiden, sprühen alle Werkzeuge und Arbeitsflächen mit 70% Ethanol und halten Dissektion Medium Flasche geschlossen. Zur Übertragung von Embryonen zwischen Gerichten, verwenden Sie einen Ausschnitt aus Kunststoff Pipette oder einem perforierten Löffel. Es ist wichtig, nicht auf....
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Diskussion
Wir haben eine Methode zu sezieren und Kultur kommissuralen Neuronen aus embryonalen Ratte Rückenmark beschrieben. Dieses Verfahren wurde routinemäßig in unserem Labor verwendet werden, um zuverlässig vorzubereiten Neuronen, die zellulären und molekularen Mechanismen der Axon Anleitung zu studieren. Für Zellbiologie und Immunchemie Experimenten Dissektion einen Wurf erzeugt genügend Neuronen. Wenn mehr Zellen benötigt werden, können wie in vielen biochemischen Experimenten Dissektion der zwei Würfe erforderlich. Für ein.......
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Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Canadian Institutes of Health Research (CIHR), der Peter Lougheed Medical Research Foundation, die McGill-Programm in Neuroengineering unterstützt, dem Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und der Canada Foundation for Innovation (CFI ). Sébastien D. Langlois wurde von einem Master-Training Award aus dem Fonds unterstützten de la recherche en santé du Québec (FRSQ) und durch einen Frederick Banting und Charles Best Canada Graduate Stipendien Master Award der Canadian Institutes of Health Research (CIHR). Wir sind dankbar, dass Jessica MT Pham für die Unterstützung bei Zahlen.
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Materialien
Dissection der embryonalen Ratte Rückenmark (siehe auch Tabelle I)
- E13 Schwangerschaft inszeniert Ratte
- Ethanol 70%
- Chirurgische Schere, Fine Science Tools
- Pinzetten, Dumont Nr. 5, Fine Science Tools
- Petrischalen
- L-15-Medium
- Dissection Mikroskop Leica
- Plastic Transferpipetten
- Mikroschere, Fine Science Tools
- Tungsten Nadeln und Pin-Halter (eine hakenförmige Nadel, einem L-Formen Nadel, eine gerade Nadel), Fine Science Tools
- Hitzeinaktivierte Pferdeserum (HiHS)
- 15 ml Plastikröhrchen
Kommissuralen Neuron Kultur (siehe auch Tabelle I)
- Gewebekultur Inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2, Feuchte gesteuert)
- Deutsch Desag Deckgläser und / oder Kunststoff Gewebekulturschalen
- Poly-L-Lysin, Sigma
- Sterile milliQ H 2 O
- Neurobasal, Invitrogen
- Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum (HiFBS)
- L-Glutamin
- B27, Invitrogen
- Penicillin / Streptomycin Antibiotika
- 37 ° C im Wasserbad
- Sterile Pasteur Pipetten
- Bunsen-Gasbrenner
- HBSS, Ca 2 + / Mg 2 +-freien, Invitrogen
- DNAse, Worthington
- MgSO 4
- Zentrifuge
- Hämazytometer
- Trypanblau-Lösung
Referenzen
- Charron, F., Stein, E., Jeong, J., McMahon, A. P., Tessier-Lavigne, M. The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance. Cell. , 113-1111 (2003).
- Fabre, P., Shimogori, T., Charron, F.
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Nachdrucke und Genehmigungen
