Summary
Eine Technik ist für die Implantation vier beschriebenen
Abstract
Aufnahme von wichtigen Nerven und Muskeln
Protocol
1. Electrode Fabrication
- So erstellen Sie die Elektrode mit einer Schere ein Stück Emaille-Beschichtung 0,001 Zoll Durchmesser Edelstahldraht ca. 2 Meter lang geschnitten. Bringen Sie einen kleinen Ball aus Kitt an jedem Ende des Drahtes, falten Sie die Kabel in zwei Hälften, und drehen Sie die Enden mit einer Twisted-Pair zu schaffen, eine so genannte Differential-Elektrode.
- Band an beiden Enden des Drahtes zu entwirren zu verhindern. Machen Sie vier differentielle Elektroden, mit einer anderen Farbe des Bandes für jedes Differential Elektrode zum Zwecke der Identifizierung (Abbildung 1A).
- Twist zwei der Differential-Elektroden zusammen, so dass zwei Zoll aufgedreht an einem Ende und 1 Zoll am anderen Ende. Wiederholen Sie mit den restlichen zwei Differential-Elektroden (Abbildung 1B).
- Twist beide Sätze von zwei differenzielle Elektroden zusammen, um sicherzustellen, dass die Enden aufgedreht bleiben. Halten Sie die Elektroden-Einheit und wenden Haushalt Silikonkleber an der Kreuzung der vier Differential-Elektroden, wobei die Enden frei. Hang und damit der Leim für mindestens 4 Stunden (Abbildung 1C) trocken.
- Zur Isolierung der Filialen lag der Elektroden-Einheit nach unten auf eine ebene, beweglich, Oberfläche wie ein Stück Holz. Fan aus den Enden und sichern Sie sie mit Klebeband. Mit einem kleinen Stück Plastik um die Elektroden-Einheit, kurz bevor es Niederlassungen erheben und zu sichern, die mit Klebeband.
- Bei einem Binokular, verwenden Pinzette zur Beschichtung der Filialen mit Silikonkleber. Die 1-Zoll langen Enden wird im Inneren des Tieres sein, so sollten sie eine sehr dünne Schicht Kleber haben. Lassen Sie den Kleber für mindestens 3 Stunden trocknen lassen.
- Kürzen Sie die 1-Zoll langen Ende eines Differential-Elektrode bis zwei Zentimeter. Auf jeden Draht, entfernen 1cm von Silikon-und Schmelz. Locken eine nackte Draht zu einem Haken für die Aufnahme. Biegen Sie den anderen Draht nach oben und weg vom Haken, dies wird als das Erdungskabel dienen. Wiederholen Sie für die restlichen drei Elektroden.
- Wählen Sie eine der vier Elektroden auf dem 2 Zoll zu beenden. Verwenden einer Pinzette zu Silikon kratzen und Email aus, auszusetzen 1cm bloßen Edelstahldraht auf jeder der 2 Drähte. Löten Sie eine Gold-Stecker an jeder der beiden Drähte. Verwenden Sie ein Stück Labor-Band bis zum Ende zu sichern und zu pflegen eine Trennung zwischen dem Boden und Aufnahme Pins. Wiederholen Sie für die restlichen drei Elektroden.
- Bringen Sie einen 1-2cm Ball der Silikon-Kleber, um die Kabel, ca. 1,5 cm von der Hakenende an die Elektroden im Inneren des Tieres zu verankern. Lassen Sie für mindestens 1 Stunde (Abbildung 1D) trocken.
Abbildung 1. Electrode Assembly Fabrication. (A) Single Differential Elektrode, bestehend aus einem gefalteten und verdreht Draht mit seinen Enden mit Klebeband befestigt. (B) Zwei Differential Elektroden miteinander verdrillt, so dass ungedreht Raum an den Enden. Verschiedenfarbige Band oder eine andere Kennzeichnung sollte verwendet werden, um die Enden zu identifizieren. (C) Alle vier Differential-Elektroden in einem einzigen Elektroden-Einheit bilden, ein einziges Kabel mit getrennten Zweige der einzelnen Elektroden an jedem Ende, mit verschiedenen Farben des Bandes markiert kombiniert. (D) endgültige Form der Elektroden-Einheit. Auf der linken Seite gibt es Haken für Aufnahmen und Masseleitungen für jeden Differentialelektrode geringelt. Auf der rechten Seite, haben Gold Anschlusspins zu den Drähten wurden für den Anschluss an den Verstärker gelötet. Eine Verankerung Kugel aus Silikon-Kleber hat auch in Richtung der linken Seite der Baugruppe platziert.
2. Vorbereitung der Tiere für die Implantation
- Wählen Sie ein gesundes Tier, das etwa 350-450g wiegt. In Reaktion auf kleine Algen, sollte das Tier beißt in Abständen von 3 bis 5 Sekunden. Die komplette Chirurgie mit Elektrodenimplantation sollte etwa eine Stunde dauern.
- Um das Tier zu betäuben, spritzen sie mit 30% w / v isotonischer MgCl 2. Um zu verhindern, der Verlust der Hämolymphe und MgCl 2, kann der Injektionsstelle in Sekundenkleber vor dem Entfernen der Nadel überzogen werden.
Abbildung 2. Schematische Darstellung, wie das Tier für Elektrodenimplantation wird merken, und die Lage des Einschnitts (angezeigt durch ein bar). - Legen Sie den narkotisierten Tier in einer Dissektion Tablett mit dem Fuß nach unten. Mit Blick auf das Tier den Kopf auf, Verschiebung der Kiemen-Bereich auf der linken Seite, so dass das Tier teilweise auf seiner Seite und lehnte ab. Pin auf der vorderen Tentakeln (Abbildung 2).
- Legen Sie das Tablett auf der Bühne eines Binokular. Prop das Tablett auf ca. 20 Grad-Winkel auf den Kopf zu erheben und sammeln Sie die Hämolymphe in den Schwanz, weit weg von den Einschnitt.
- Mit Dissektion Schere, starten Sie einen Schnitt leicht nach rechts von der Augenfleck und erweitern es 1 bis 1,5 cm nach vorn. Verwenden Sie Retraktoren, an den Kanten des Tabletts den Einschnitt offen zu halten (Abbildung 2; beachten Bar in der Nähe eyespot Angabe Schnitt).
- Zur Freilegung der bukkalen Masse, verwenden ForcePs zu heben das klare Membran unter der Haut und mit einer Schere, um eine Öffnung passend zur wichtigsten Einschnitt geschnitten. Tuck die Ränder der Membran in die Retraktoren.
3. Elektrodenimplantation
- Platzieren Sie die Elektroden-Einheit auf einem Mikromanipulator und bewegen Sie ihn über das Tier Einschnitt.
- Die radular Nerv ist am schwierigsten zu zugreifen, und sollte zuerst angegangen werden. Es gibt zwei Möglichkeiten für den Zugriff auf die radular Nerven.
- Die erste Option, was bevorzugt ist, wird unter der bukkalen Ganglion zwischen BN1 und BN2 aussehen. Wenn ein Zweig der radular Nerven sichtbar ist, verwenden Sie spitzen Pinzette gebogen in einen Haken zu heben aus der Branche (Abbildung 3, Schleife von RN unter Ganglion bezeichnet 1).
- Wenn ein Zweig der radular Nerven nicht zugänglich ist über dem Muskel, wird eine zweite Option, um sie über einen kleinen Einschnitt in I2 neben dem Bindegewebe an der Basis der bukkalen Ganglion (Abb. 3, RN unter Muskel bezeichnet 2) zugreifen. Der Einschnitt in I2 muss durch zwei Lagen des I2 Muskel gehen. Halten Sie an den Rand des Muskels Schnitt mit geraden Pinzette und verwenden Sie den Haken Zange herauszuziehen ein RN Branche.
- Halten Sie die Nerven mit dem Haken Zange, eine andere Reihe von Zangen an der Elektrode Haken auf die Nerven zu manipulieren.
- Verwenden Sie den Mikromanipulator an den Haken zu erhöhen, so dass der Nerv sich weg von der bukkalen Masse abgehoben und frei von jeglichen anderen Nerven oder Gewebe. Nicht überdehnen den Nerv.
- Trocknen Sie die Elektrode mit einem Kim-Wipe oder Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit mit einer Spritze. Wasser Spannung kann dazu führen, den Mut, sich zusammenstürzen, oder ein Wasser-Dichtung unter dem Nerven bilden. In jedem Fall sollte die Fläche vollständig getrocknet sein, bevor Klebstoff aufgetragen wird.
- Tragen Sie eine kleine Klecks Sekundenkleber, wo die Basis des Hakens ist in Kontakt mit dem Boden des Nervs. Tragen Sie einen Tropfen von Aplysia Kochsalzlösung oder Hämolymphe der Sekundenkleber gesetzt. Wenn der Kleber nass ist nichts als sollte verschoben werden immer Leim zwischen Draht und Nerven blockieren würde die elektrische Verbindung.
- Trocknen Sie die Haken wieder. Mix Kwik-Sil Kleber auf einen Eisbeutel.
- Verwenden Sie die Spitze eines Stiftes, eine kleine Menge des Kwik-Sil Kleber gelten, vollständig bedecken freiliegende Leiter des Hakens, aber nicht das Erdungskabel.
- Lassen Sie den Kleber für ca. 5 Minuten eingestellt, Nachjustierung der Leim, wenn sie wegzieht von Teilen der Haken. Der Leim wird gesetzt, wenn es nicht mehr klebt, wenn sie mit dem Stift berührt (Abbildung 4 zeigt die endgültige Konfiguration).
- Sobald die radular Nerven Elektrode eingestellt ist, kann der I2 Muskel zugegriffen werden. Im Bereich zwischen BN1 und BN2, die süchtig Pinzette Haken und 2 Bänder des I2 Muskel vom Rest des Muskels getrennt durch leichtes Ziehen die Bands nach oben. Befestigen Sie die Elektrode mit dem gleichen Verfahren.
- Bukkalen Nerven 2 und 3 sind leicht zugänglich und Elektroden sind mit dem gleichen Verfahren angebracht.
- Nachdem alle Elektroden angebracht sind, schieben Sie die Elektroden-Einheit in das Tier bis das Silikon zu verankern.
- Suture der Einschnitt verschlossen um den hervorstehenden Elektrodenkabel, halten die Anker in das Tier. Sekundenkleber die Stiche, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten.
- Legen Sie die Gold-Anschlussstecker am anderen Ende der Elektrode in einem kleinen Block aus Styropor. Zurück das Tier an den Haupttank in einem belüfteten Isolation Behälter für Erholung über Nacht.
Abbildung 3. Ein Diagramm der Aplysia Zuführvorrichtung als die bukkale Masse bekannt. Dargestellt sind die bukkalen Nerven (BN1, BN2, BN3), die radular Nerven (RN), die Ausgänge der Unterseite des bukkalen Ganglion, dann taucht unter dem Muskel, und die Lage auf dem I2 Muskel, wo die Elektroden angebracht ist.
Abbildung 4. Schematische Darstellung der einzelnen Elektrode an einen Nerv (oder Muskel) und verklebt. Beachten Sie, dass die de-isolierten Region des gewellt Haken in direkten Kontakt mit den Nerven (oder Muskel), an Stelle mit Sekundenkleber verankert ist, und elektrisch von dem fluiden Medium mit Kwik-Sil isoliert. Beachten Sie auch, dass die deinsulated Spitze der Masseelektrode, um das flüssige Medium ausgesetzt ist.
4. Aufnahme
- Akklimatisieren das Tier in einem belüfteten Behälter während des Kontrollgeräts für mindestens 1,5 Stunden angebracht. Monitor das Signal, während das Tier gewöhnen, um sicherzustellen, dass alle Elektroden arbeiten und dass das Geräuschniveau niedrig sind.
- Verwenden Sie eine Videokamera an Fressverhalten aufzeichnen, während Sie den Computer auf Signale von der Nerven-und Muskel-Elektroden aufnehmen. Synchronisieren Sie die Video-und Elektroden-Aufnahmen mit einem Rechtecksignal, dass ein digitaler Zähler in die Kamera-Ansicht steuert, während es gleichzeitig als zusätzlicher Kanal auf dem Computer in Axosc aufgezeichnetOPE.
- Feeding Verhaltensweisen sind von den Techniken in Morton und Chiel 1993 beschrieben ausgelöst.
Obwohl wirbellosen Tieren nicht eine formelle Genehmigung durch eine institutionelle Nutzung von Tieren und Pflege Ausschuss haben wir sichergestellt, dass alle Behandlungen der Aplysia Schaden zu minimieren und Leiden für das Tier, und dass alle chirurgischen Techniken sind fertig, während das Tier vollständig betäubt.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 5. (A) Gleichzeitige Vier-Kanal-Aufnahmen aus einem Muskel (dem Winkelmesser Muskel I2), und aus drei bukkalen Nerven (die radular Nerven, RN, N. buccalis 2, BN2 und N. buccalis 3, BN3) während eines Schlucken Antwort. (B) ein Standbild aus der gleichzeitigen Video-Aufzeichnung der frei verhalten Tier, als es schluckt eine vorgeschnittene Algen Streifen (0,5 cm in der Breite), die bei 0,5 cm Abstand mit weißen Bändern markiert wurde, so dass seine Bewegungen können leicht sichtbar gemacht werden, wie der Tierfutter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eine wichtige Innovation, die aus diesen Aufnahmen bewährt hat sich die Kombination der Elektroden in einem Kabel. Zwei Elektroden Aufnahmen wurden bereits verwendet, sondern baut auf vier einzelnen Elektroden führte zur Bildung von chirurgischen Adhäsionen, die oft verhindert das Tier aus machen normale Fress-Bewegungen. Die Kombination der Elektroden in einem Kabel reduziert die Masse der Elektroden im Inneren des Tieres, das wiederum reduziert die Immunantwort und ermöglicht es dem Tier, sich freier zu bewegen.
Die andere innovative Aspekt dieses Verfahrens ist die Kombination von Sekundenkleber und Kwik-Sil die Elektroden an den Nerven oder Muskeln befestigen. Zuvor hatte nur Sekundenkleber benutzt worden, aber die Kombination der beiden Kleber arbeitet zuverlässiger und kann mehrere Tage dauern länger als Sekundenkleber, die bricht in ca. 3 Tagen, wenn sie Wasser ausgesetzt.
Wir haben gezeigt, dass es möglich ist, extrazelluläre Elektroden in intakten, sich verhaltenden Tier Implantat für die Aufnahme oder die Stimulation von der Zellkörper der einzelnen identifizierten Neuronen [Warman und Chiel, 1995;. Lu et al, 2008]. Die multiple Elektroden-Technik, die wir in diesem Papier beschrieben haben könnte somit verwendet, um gleichzeitig von Plattenfirmen und manipulieren die Aktivität von vier verschiedenen identifizierten Neuronen, oder eine Kombination von Neuronen, Muskeln und Nerven werden.
Wir nutzen die Technik mit vier Elektroden, aber es ist wahrscheinlich, dass es für mehrere zusätzliche Elektroden zu arbeiten. Darüber hinaus in einer unveröffentlichten Experiment wurden diese Elektroden verwendet werden, um aus der pudental Nerv der Ratte aufnehmen, was darauf hinweist, dass Aspekte dieser Technik könnte in Wirbeltieren und beim Menschen nützlich.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wir bedanken uns für die Unterstützung aus dem NIH (NS047073 zu HJC). Wir sind auch dankbar, dass Catherine Kehl für ihre frühen Experimente mit Kwik-Sil, die uns, sie für unsere Anwendung gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
