Summary
Tekniği dört implante
Abstract
Anahtar sinirler ve kaslar kayıt
Protocol
1. Elektrot Fabrikasyon
- Elektrot oluşturmak için, yaklaşık 2 metre uzunluğunda, emaye kaplı, 0.001 inç çapında paslanmaz çelik tel bir parça kesmek için makas kullanın. Macun, telin her iki ucuna da küçük bir topu takın yarısında tel kat ve bükümlü çift oluşturmak için biter Spin diferansiyel elektrot denir.
- Teyp çözülüyor önlemek için tel uçlarının her ikisini de. Tanıtım amaçlı her diferansiyel elektrot (Şekil 1A) için dört bant farklı bir renk kullanılarak diferansiyel elektrotlar, olun.
- Iki santim bırakarak birlikte diferansiyel elektrotlar, Büküm iki diğer ucunu bir ucunu ve 1 inç bükümsüz. Diferansiyel elektrotlar kalan çifti (Şekil 1B) ile tekrarlayın.
- Biter bükümsüz kalacağından emin birlikte iki diferansiyel elektrotların her iki çevirin. Elektrot montaj kadar tutun ve biter serbest bırakarak, dört diferansiyel elektrotlar kavşakta ev silikon yapıştırıcı uygulayın. Kapatın ve en az 4 saat (Şekil 1C) tutkalın kurumasını bekleyin.
- Dalları izole etmek için, böyle bir ahşap parça, düz, hareketli, yüzey elektrot montaj uzandı. Biter Fan ve bant ile sabitleyin. Dallarına hemen önce elektrot montaj yükseltmek ve bu bandı ile güvence altına almak için küçük bir plastik parçası kullanın.
- Diseksiyon mikroskobu, silikon yapıştırıcı ile kat dalları için forseps kullanabilir. 1-inç uzunluğunda uçları hayvan içinde olacaktır, bu yüzden çok ince bir kat tutkal olmalıdır. Tutkal en az 3 saat boyunca kurumasını bekleyin.
- Bir diferansiyel elektrot 1-inç uzunluğunda son iki santimetre kısaltın. Her tel, silikon ve emaye 1cm çıkarın. Kayıt için bir kanca içine bir çıplak tel Curl. Kanca diğer tel bükün ve uzak; bu zemin tel olarak hizmet verecek. Kalan üç elektrotlar için tekrarlayın.
- 2 inç ucundaki dört elektrot birini seçin. Silikon kazımak ve çıplak paslanmaz çelik tel 2 tel her 1cm açığa kapalı minesi forseps kullanın. Altın konnektör her iki tel lehim. Sonunda, güvenli ve toprak ve kayıt pinleri arasındaki mesafeyi korumak için bir parça laboratuvar bant kullanın. Kalan üç elektrotlar için tekrarlayın.
- Kanca sonundan itibaren yaklaşık 1,5 inç hayvan içindeki elektrotlar demirlemek için, kablo, silikon tutkal 1-2cm topu takın. En az bir saat (Şekil 1D) kurumasını bekleyin.
Şekil 1 Elektrot Meclisi Fabrikasyon. (A) Tek diferansiyel elektrot bant ile sabitlenir biter katlanmış ve bükümlü tel oluşan. (B) İki diferansiyel elektrot ucunda bükümsüz boşluk bırakarak, birlikte bükülmüş. Farklı renkli bant veya başka bir işaretleme uçları tanımlamak için kullanılmalıdır. (C) Tüm dört diferansiyel elektrotlar her iki ucundaki özel elektrotlar bant farklı renk ile işaretlenmiş ayrı dalları ile tek bir kablo oluşturan tek bir elektrot montaj birleştirilir. (D) Final elektrot montaj şeklinde. Sol tarafta, her diferansiyel elektrot için kayıtları ve zemin teller için kancalar var kıvrılmış. Sağ tarafta, altın konektör pimleri amplifikatör bağlantısı için kablolara lehimlenmiştir edilmiştir. Silikon tutkal demir bir topu da montaj sol tarafına doğru yerleştirildi.
2. İmplantasyon için Animal hazırlanması
- Yaklaşık 350-450g ağırlığında sağlıklı bir hayvan seçin. Yosun küçük parçalar yanıt olarak 3 ila 5 saniye aralıklarla hayvan ısırıkları oluşturmanız gerekir. Elektrot implantasyonu ile ameliyat yaklaşık bir saat sürer.
- Hayvan uyutmak için,% 30 w / v izotonik MgCl 2 ile enjekte edilir. Hemolimf ve MgCl 2 kaybını önlemek için, enjeksiyon yerinde iğne çıkarmadan önce superglue kaplanabilir.
Şekil 2'de şematik hayvan elektrot implantasyonu için nasıl tutturulmuş gösteren diyagramı ve kesi yeri (bir çubuk ile gösterilir). - Aşağı, ayak ile bir diseksiyon tepsi anestezi hayvan yatırın. Hayvan baş bakan, hayvan uzakta eğilerek, kısmen kendi tarafında olduğunu, sol gibi solungaç alana kaydırmak. Anterior Tentacles (Şekil 2) aşağı pin.
- Diseksiyon mikroskobu sahnede tepsiye yerleştirin. Başını yükseltmek ve kesi uzak, kuyruk hemolimf toplamak için yaklaşık 20 derecelik bir açıyla tepsi Prop.
- Diseksiyon makas kullanarak, Kuşgözü sağa doğru hafifçe bir kesi başlatmak ve anteriora 1.5cm 1 uzatmak. Tepsinin kenarlarına bağlı kesi açık tutun retraktörler (Kuşgözü belirten kesi yakın not çubuğu Şekil 2) kullanın.
- Bukkal kitle ortaya çıkarmak için, forseps kullanımı altında net bir zar kaldırmak içincilt ve kullanımı makas ana kesi ile eşleşen bir açılış kesmek için. Retraktörlere membran kenarları Tuck.
3. Elektrot İmplantasyon
- Bir mikromanipülatör elektrot montaj yerleştirin ve hayvan kesi üzerine taşımak.
- Radular sinir erişmek için en zor ve öncelikle ele alınmalıdır. Radular sinir erişmek için iki seçenek vardır.
- İlk seçenek, tercih edilir BN1 ve BN2 arasında yanak ganglion altına bakın. Radular sinirin bir dalı görünmüyorsa, (Şekil 3 1 etiketli ganglion altında RN döngü) şube kaldırmak için ince uçlu bir kanca içine eğildi forseps kullanabilir.
- Radular sinirin bir dalı kas üzerinde erişilebilir değilse, ikinci bir seçenek I2 yanak ganglion tabanı (Şekil 3, 2 etiketli kasi RN) bağ dokusu yanında küçük bir kesi yoluyla erişmek için. I2 içinde kesi I2 kas iki kat üzerinden gitmek gerekir. , Düz forseps ile kas kesi kenarına tutun ve bir RN şube çekin bağladım forseps kullanabilir.
- Bağladım forseps ile sinir tutarken, sinir üzerine elektrot kanca işlemek için farklı bir forseps kullanın.
- Sinir yanak kitle uzak kaldırdı, böylece kanca yükseltmek için mikromanipülatör kullanın ve herhangi bir diğer sinirlere veya doku açık. Sinir aşırı zorlanma etmeyin.
- Elektrot bir şırınga ile aşırı sıvı kapalı bir Kim-Wipe ya da emme kullanarak kurutun. Su gerginlik, sinir, kendi üzerine çökmesi veya sinir altında oluşturmak için bir su mühür neden olabilir. Her iki durumda yapıştırıcı uygulanmadan önce, bölge tamamen kurutulmuş olmalıdır.
- Kanca baz sinirin alt temas superglue küçük bir dab uygulayın. Superglue ayarlamak için tuzlu su ya da hemolimf Aplysia bir damla uygulayın. Tel ve sinir arasındaki tutkal, yapıştırıcı, ıslak bir şey olarak hareket ettirilmelidir olduğunda elektrik bağlantısını bloke edecek.
- Kanca tekrar kurutun. Bir buz paketi üzerinde Mix Kwik-Sil tutkal.
- Kanca tamamen açıkta tel kaplama Kwik-Sil tutkal küçük bir miktar uygulamak için bir toplu iğne ucu, ama topraklama kablosu kullanın.
- Yapıştırıcı, tutkal tekrar ayarlanmasına kanca bölümleri uzak çeker, yaklaşık 5 dakika için ayarlamak için izin verin. Tutkal uzun sopalarla pin (Şekil 4 nihai yapılandırmasını göstermektedir) dokunduğu zaman ayarlanır.
- Radular sinir elektrot ayarlandıktan sonra, I2 kas ulaşılabilir. BN1 ve BN2 arasındaki alanda, kanca, çengel forseps kullanımı ve 2 bantlı bantların hafifçe yukarı çekerek I2 kas kas geri kalanından ayırmak için. Elektrot aynı prosedürü kullanarak takın.
- Bukkal sinirler 2 ve 3 kolayca erişilebilir ve elektrotlar aynı prosedüre bağlı.
- Bir kez tüm elektrotlar silikon çapa kadar hayvan içine elektrod montaj slayt eklenir.
- Kesi, hayvan içinde çapa tutarak, çıkıntılı elektrot kablosu etrafında kapalı dikin. Iyi bir sızdırmazlık sağlamak için dikiş superglue.
- Elektrodun diğer ucundaki altın konektör uçları strafor küçük bir blok içine yerleştirin. Hayvan kurtarma gecede bir gazlı izolasyon konteyner ana tank için geri dönün.
Şekil 3 yanak kitle olarak bilinen Aplysia besleme cihazların şeması. (BN1, BN2, BN3) bukkal sinirler çıkar alt yanak ganglion sonra kasi daldırır radular sinir (RN) ve elektrot bağlı olduğu I2 kas üzerindeki konumu gösterilebilir.
Şekil 4 şematik bir sinire bağlı (veya kas) ve yerine yapıştırılmış tek bir elektrot . Kıvrılmış kanca de yalıtımlı bölge superglue ile yerde demirlemiş sinir (veya kas), doğrudan temas ve elektrikle Kwik-Sil kullanarak sıvı ortamdan izole edin. Toprak elektrot deinsulated ucu sıvı ortama maruz unutmayın.
4. Kayıt
- Gazlı bir kap içinde en az 1.5 saat kayıt cihazları takılı iken hayvan gelmesini. Hayvan tüm elektrotlar çalışma ve gürültü seviyeleri düşük olduğunu doğrulamak için acclimating iken sinyal izleyin.
- Sinir ve kas elektrotlar gelen sinyalleri kaydetmek için bilgisayar kullanırken beslenme davranışını kaydetmek için bir video kamera kullanın. Aynı anda Axoscope bilgisayarda ek bir kanal olarak kaydedilir iken bir dijital kamera görünümüne sayacı kontrol eden bir kare dalga sinyal kullanarak video ve elektrot kayıtları senkronize etme.
- Davranışları Besleme de teknikleri ile teminMorton ve Chiel 1993 kayıtsız kalamayız.
Omurgasız hayvanlar kurumsal bir hayvan kullanımı ve bakımı komitesi tarafından resmi onayı gerekmez rağmen, biz Aplysia tüm tedavilerin zararı en aza indirmek ve hayvan için acı ve hayvan tamamen anestezi ise tüm cerrahi teknikler yapılır sağlamıştır.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 5 (A) kas (iletki kas I2) aynı anda dört kanal kayıtları ve yutma yanıt sırasında üç yanak sinirler (radular sinir, RN, yanak sinir 2, BN2 ve bukkal sinir 3, BN3) . Yutar hareketleri gibi kolayca görüntülenebilmekte böylece beyaz şeritler ile 0.5 cm aralıklarla işaretlenmiş olan bir hazır kesilmiş yosun şerit (0.5 cm genişlik) olarak özgürce davranmak hayvanın aynı anda video kayıt (B) bir fotoğraf karesi hayvan yemleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kayıtların başarılı kılan önemli yenilik, tek bir kablo içine elektrotlar birleştiriyor. İki elektrot kayıtları önce kullanılan, ancak dört ayrı elektrotlar genişleyen genellikle normal beslenme hareketleri yapmaktan hayvan engelledi cerrahi yapışıklıkların oluşumuna neden olmuştur. Tek bir kablo içine elektrotlar birleştiren da bağışıklık yanıtı azaltır hayvan, içine elektrotlar toplu azaltır ve hayvan daha serbestçe hareket etmesine olanak sağlar.
Bu prosedürün diğer yenilikçi yönü, sinir ya da kas elektrotlar eklemek superglue ve Kwik-Sil kombinasyonu. Daha önce, sadece superglue kullanılır olmuştu, ancak iki yapıştırıcılar kombinasyon daha güvenilir bir şekilde çalışır ve birkaç gün yaklaşık 3 gün içinde suya maruz kaldığında parçalanır superglue daha uzun sürebilir.
Biz bireysel nöronların hücre gövdeleri kayıt ya da uyarılması için sağlam hareket eden bir hayvana ekstrasellüler elektrotlar implant mümkün olduğunu göstermiştir [Warman ve Chiel, 1995;. Lu ve ark, 2008]. Bu yazıda anlatılan birden fazla elektrot tekniği, böylece aynı anda kayıt ve dört farklı tespit nöron veya nöronlar, kaslar ve sinirler bir arada faaliyet işlemek için kullanılan olabilir.
Biz dört elektrot tekniği kullanılarak, ancak bunun birkaç ek elektrotlar için çalışacağını söyledi muhtemeldir. Ayrıca, yayınlanmamış bir deneyde, bu elektrotlar, bu tekniğin yönlerini, omurgalı hayvanlarda ve insanlarda yararlı olabileceğini belirten, sıçan pudental sinir kayıt için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz minnetle NIH (NS047073 YYK) desteğiyle kabul etmiş sayılırsınız. Biz de, bize uygulama için kullanmaya teşvik Kwik-Sil, onu erken deneyler için Catherine Kehl minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire Company | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE Healthcare | ||
| Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Duro Qwik-Gel superglue | Henkel Corp | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings:100-1000Hz nerves,10-1000Hz I2 muscle | |
| Axoscope 10.1 | Molecular Devices | ||
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 |
References
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural Eng. 5, 287-309 (2008).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J Comp. Physiol. A. 172, 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57, 161-169 (1995).
- Ye, H., Morton, D. W., Chiel, H. J., J, H. nbsp;Neuromechanics of multifunctionality during rejection in Aplysia californica. J. Neurosci. 26, 10743-10755 (2006).
