Analysieren Antworten der Maus Riechzellen Mit der Air-Phase Electroolfactogram Recording

Zusammenfassung

Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen und zuverlässige Methode zur Beurteilung Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Dieses Protokoll beschreibt eine Aufnahme-Setup, Maus Gewebe Vorbereitung, Datenerfassung und grundlegende Analyse der Daten.

Zusammenfassung

Tiere abhängen Geruchssinn für viele kritische Verhaltensweisen, wie die Suche nach Nahrung, Vermeidung von Raubtieren, und die Identifizierung Artgenossen zur Paarung und anderen sozialen Interaktionen. Die electroolfactogram (EOG) Aufnahme ist eine informative, leicht zu führen, und zuverlässige Methode, um Test Riechfunktion auf der Ebene des olfaktorischen Epithels. Seit der 1956 Beschreibung des EOG durch Ottoson in Frösche ¹ hat die EOG Aufnahme in vielen Wirbeltieren, einschließlich Salamander, Kaninchen, Ratten, Mäusen und Menschen (Bewertet von Scott und Scott-Johnson, 2002, ref. 2) angewendet worden. Die jüngsten Fortschritte in der genetischen Modifikation in Mäusen haben Interesse an der Aufnahme der EOG für physiologische Charakterisierung der olfaktorischen Funktion in Knock-out neu entfacht und knock-in Mäusen. EOG-Aufnahmen wurden erfolgreich eingesetzt, um die zentrale Rolle der olfaktorischen Signaltransduktion Komponenten ^3-8 zeigen, und in jüngerer Zeit auf den Beitrag bestimmter Regulationsmechanismen zu OSN Antworten ^9-12 charakterisieren.

Odorant Erkennung tritt an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf der Zilien OSNs, wo eine Signaltransduktionskaskade führt zu der Ionenkanäle öffnen und erzeugt einen Strom, der in die Zilien fließt und depolarisiert die Membran ^13. Die EOG ist das negative Potential extrazellulär an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf Geruchsstoff Stimulation aufgezeichnet, die sich aus einer Summierung der möglichen Veränderungen von einzelnen reagieren OSNs in der Aufnahme Feld ² verursacht. Vergleich der Amplitude und Kinetik der EOG somit wertvolle Informationen darüber, wie genetische Modifikation und andere experimentelle Manipulationen Einfluss auf die molekulare Signalwege zugrunde liegenden OSN Reaktion auf Geruch.

Hier beschreiben wir eine Luft-Phase EOG Aufnahme auf eine Vorbereitung der Maus olfaktorischen Nasenmuscheln. Kurz, nachdem dabei die Maus, sind die olfaktorischen Nasenmuscheln durch Halbierung der Kopf entlang der Mittellinie und das Entfernen des Septum ausgesetzt. Die Nasenmuscheln Präparat wird dann in den Aufnahme-Setup gelegt, und eine Aufnahme-Elektrode an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels auf einer der medialen Nasenmuschel platziert. Eine Referenzelektrode ist elektrisch mit dem Gewebe durch eine Pufferlösung verbunden. Ein kontinuierlicher Strom von befeuchtete Luft über die Oberfläche des Epithels, um ihn feucht zu halten geblasen. Der Dampf von Geruchsrezeptoren Lösungen ist in den Strom der befeuchtete Luft auf das Epithel stimulieren aufgeblasen. Antworten werden aufgezeichnet und digitalisiert für die weitere Analyse.

Protokoll

Teil 1. Die EOG Aufnahme-Setup

Die Aufnahme Apparat besteht aus einer Aufnahme, Referenzelektrode, Luft-Zuführungsrohr, Objekttisch und Binokular, alle auf einer Luft-Tabelle in einem Faradayschen Käfig verankert. Mikromanipulatoren sind für die Platzierung der Elektroden und die Luft Zuführungsrohr verwendet. Ein kontinuierlicher Luftstrom wird durch destilliertes Wasser geleitet, um Feuchtigkeit, bevor sie durch die Luft Zuführungsrohr und über die Probe hinzufügen. Ein 60 mm Kulturschale mit Sylgard zu einer Tiefe von 6-8 mm gefüllt ist als Montagefläche für die Probe verwendet. Ein Brunnen und ein Kanal aus dem Sylgard in der Montage Gericht um ein Mittel bereitzustellen, um elektrischen Verbinden der Referenzelektrode auf die Probe über modifizierte Ringer-Lösung ausgehöhlt.

Die Aufnahme-Elektrode und der Referenzelektrode sind an einen Verstärker angeschlossen. Signale aus dem Verstärker sind mit einem Digitizer gesendet und dann an einen Computer. Software wie Axograph oder pClamp kann die Stimulation Protokoll steuern, um das Signal aufnehmen, und für die anschließende Analyse der Antworten sein. Ein Oszilloskop nach dem Verstärker angeschlossen werden können für die Echtzeit-Überwachung des elektrischen Potentials beim Aufsetzen der Aufnahme-Elektrode und während EOG Aufnahmen bequem.

Lieferung von Geruchsrezeptoren Reize wird durch eine Picospritzer, die auf dem gleichen Computer zur Signalerfassung eingesetzt angeschlossen gesteuert wird. Der Luftdruck an der Picospritzer ist auf 10 psi eingestellt. Ein einziger Lufttank und Regler lassen sich Luft, um sowohl die Luft-Tabelle und die Picospritzer zu versorgen. Eine zweite Luft Tank und Regler wird verwendet, um Luft für die befeuchtete Luft Strom liefern, als dies erfordert einen geringeren Druck und eine große Menge des Luftstroms. Kurz vor der Bereitstellung eines Geruchs Reiz ist die Picospritzer Ausgang mit einem Duftstoff-Flasche angeschlossen. Der Duftstoff-Flasche wird dann an der Luft Zuführungsrohr verbunden.

Teil 2: Herstellung von Elektroden

Die Aufnahme Elektrode ist ein chlorierten Silberdraht in einer gezogenen Glas mit modifizierten Ringer-Lösung (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl _2, 1,5 mM MgCl _2, 10 mM HEPES, pH 7,4, sterilfiltriert) gefüllte Kapillare. Die Bezugselektrode ist eine chlorierten Silberdraht.

1. Installieren Silberdraht in den Elektrodenhalter. Für die Aufnahme Elektrode sollte 1-2 Zentimeter Draht aus dem Ende der Elektrode Halter herausragen. Mehr Draht kann für die Referenzelektrode gelassen werden.
2. Um die AgCl Schicht auf den Silberdraht hinzuzufügen, positionieren Sie den Draht in 0,1 M NaCl und verbinden Sie den Elektrodenhalter mit dem Pluspol einer 1,5-9 V DC Stromquelle. Der negative Pol der Stromquelle sollte elektrisch mit dem 0,1 M NaCl-Lösung verbunden werden. Lassen Sie die chloriding Reaktion für 10 Minuten gehen. Zum Ausgleich keine statische Aufladung zwischen der Aufnahme und der Referenz-Elektrode, kurz berühren die Elektroden zusammen, bevor Sie sie auf dem Aufzeichnungsgerät.
3. Ziehen Sie eine Glaskapillare mit einer Mikropipette Abzieher. Die Öffnung an der Spitze der Kapillare sollte etwa 5-10 Mikrometer im Durchmesser sein.
4. Verwenden Sie einen Diamanten Bleistift ein Tor und brechen das stumpfe Ende der Kapillare so ~ 2 cm länger als der Silberdraht ist. Fire-Politur das abgeschnittene Ende mit dem Butan Fackel.
5. Melt 0,5% Agarose in modifizierter Ringer-Lösung. Ziehen Sie eine kleine Menge des geschmolzenen Agarose-Lösung in die Spitze der Elektrode mit einer Transferpipette.
6. Füllen Sie die Kapillare gezogen über 1 / 2 des Weges mit modifizierten Ringer-Lösung (mit einer Spritze, die erhitzt worden und zog einen langen, dünnen Ende haben, ist für diesen Zweck nützlich). Gently flick die Kapillare, um mögliche Luftblasen zu entfernen. Lagern Sie die gefüllten Elektrode in den Vorratsbehälter mit einer kleinen Menge von modifizierten Ringer-Lösung in den Boden, bis sie bereit sind, verwendet werden sollen. Sobald eine Gewebeprobe wird vorbereitet und bereit für die Aufnahme, installieren Sie eine gefüllte Kapillare über die Aufnahme Drahtelektrode.

Teil 3: Vorbereitung Duftstoff-Lösungen

Die Geruchsstoffe Amylacetat und Heptaldehyd wecken große Antworten und sind somit eine gute Wahl, wie EOG Stimulanzien.

1. In Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine Reihe von Verdünnungen von Geruchsrezeptoren in Dimethylsulfoxid (DMSO). Als Ausgangspunkt für eine Dosis-Wirkungs-Kurve, bereiten 10-fach Verdünnungen von 5 m bis 5 x 10 ^-6 M. Machen Sie frische Verdünnungen jeden Tag.
2. Weitere verdünnen Geruchsstoffe 50-fach in Wasser durch Mischen von 100 ul verdünnt Lager in DMSO mit 4,9 mLs Wasser in 2 Unzen-Flaschen mit Silikon-Stopfen. Lassen Sie die Lösungen in die Flaschen ins Gleichgewicht für mindestens 30 Minuten. Beachten Sie, dass der Dampf Konzentration von Geruchsstoffen in jeder Flasche unbekannt ist, wird aber in Abhängigkeit von der Konzentration der Duftstoffe in der flüssigen Phase variieren.
3. Legen Sie zwei 18-Gauge-Nadel durch das Silizium Anschlag auf provide Eingang und-Ausgang. Die Häfen sollten angeschlossen werden, wenn die Flasche nicht in Gebrauch ist.

Teil 4: Aufzeichnung des EOG und Analyse von Daten

1. Sacrifice eine Maus durch CO _2-Euthanasie oder betäubende Überdosierung durch Enthauptung folgten. Entfernen Sie die Haut über den Schädel und sagittal halbieren dem Kopf entlang der Mittellinie.
2. Hängen Sie eine Hälfte des Kopfes, medial nach oben auf die Halterung Gericht. Entfernen Sie vorsichtig das Septum der Nasenmuscheln aussetzen.
3. Die Schale mit montiertem Gewebe auf die Aufnahme der Bühne. Richten Sie die Bühne, so dass die Aufnahme Lage auf dem Nasenmuscheln unter dem Mikroskop zentriert ist.
4. Schalten Sie den Lufttank zu befeuchtete Luft auf die Nasenmuschel Oberfläche liefern. Positionieren Sie die Luftzufuhr Rohr, so dass es etwa 10 mm vom Aufnahmeort. Der Durchfluss wird ~ 600 mL / min.
5. Stellen Sie den Verstärker an DC-Modus (AC Verstärkung wird Artefakte in der EOG-Signal zu induzieren) mit Low-Pass-Filter bei 1 kHz, und Verstärkung bei 100X.
6. Montieren Sie die Aufnahme-und Referenzelektrode auf der Mikromanipulatoren.
7. Senken Sie die Referenz-Elektrode in den Brunnen auf der Montagefläche legen und mit modifizierten Ringer-Lösung, so dass es elektrisch mit dem Gewebe verbunden.
8. Vorsichtig das Aufnahme-Elektrode auf die Oberfläche der Nasenmuschel IIb oder III. Die Elektrode sollte kaum berühren die Oberfläche des olfaktorischen Epithels! Wenn die Elektrode in Kontakt mit dem Epithel kommt (dh Abschluss einer elektrischen Schaltung) wird eine gerade Basislinie wird im Oszilloskop angezeigt werden.
9. Bringen Sie einen Geruchsstoff Flasche auf die Seite Port auf dem Luft-Zuführungsrohr.
10. Auf dem Computer, starten Sie eine Stimulation Protokoll. Die Abtastrate für die Datenerfassung sollte 2 kHz oder höher sein. Die Software löst ein Geruch Puls und Aufzeichnung starten.
11. Ein typisches Stimulationsprotokoll kann ein 100-ms Dauer einzelner Impuls, gepaart 100-msec Pulse durch einen 1-Sekunden-Intervall getrennt, oder eine 10-sec Dauerimpuls werden.
12. Warten Sie einige Zeit zwischen den Protokollen, so das Gewebe minimal angepasst ist. Eine Minute reicht für flüssige Konzentrationen von Amylacetat und Heptaldehyd bis zu 10 ^-3 M, bei höheren Konzentrationen können 5 Minuten. Nach der Abgabe hoher Geruchs-Konzentrationen (z. B. am Ende einer Dosis-Wirkungs-Kurve) Restgeruch kann in der Röhre bleiben. Waschen Sie den Luftschlauch mit 95% Ethanol und trocken, bevor Sie fortfahren mit zusätzlichen Gewebeproben.
13. Axograph Software bietet Werkzeuge für die Messung wichtigen Parameter der EOG-Signal. Solche Parameter sind die Antwort Amplitude, Latenz, die Zeit bis Spitze, und Zeitkonstanten der Kündigung. Es kann wünschenswert sein, um digital Filter Spuren bei 25 Hz vor der weiteren Analyse.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Parameter für die EOG-Analyse. Verschiedene Parameter der EOG sind besonders nützlich für den Vergleich der Antworten zwischen Mäusen, einschließlich der Reaktion Amplitude, die Latenz (die Zeit zwischen dem Reiz verabreicht wird und die Reaktion beginnt), steigen (die Zeit zwischen dem Start der Reaktion und der Spitze), Zeit bis zur maximalen (die Zeit vom Beginn der Stimulation an die Spitze der Reaktion) und Zeitkonstante der Kündigung (τ, bestimmt durch den Einbau der Decay-Phase der Reaktion auf eine einzelne Exponentialgleichung ). Zum Vergleich der kinetischen Parameter wie Latenz, Anstiegszeit und Zeitkonstante der Kündigung, ist es ratsam, die Spitzenamplitude der Antworten vor der Analyse zu normalisieren.

Abbildung 2. Vertreter EOG-Signale unter verschiedenen Stimulationsprotokolle. (A) Beispiele für EOGs von einer Maus in Reaktion auf die Stimulation mit steigenden Konzentrationen von Amylacetat. Die schwarze Linie am oberen Rand des Panels zeigt den Zeitpunkt und die Dauer von Geruchsrezeptoren Stimulation. Die Konzentrationen in der Legende sind die Konzentrationen der flüssigen Lösung. (B) Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung im Durchschnitt von fünf Mäusen. Fehlerbalken sind 95% Konfidenzintervall. Ein Rückgang in der Amplitude ist oft bei sehr hohen Konzentrationen Geruch beobachtet. (C) Ein Beispiel für ein EOG in Reaktion auf ein gekoppeltes-Puls-Stimulation. Ein einzelner kurzer Impuls von Geruchsrezeptoren entlockt Anpassung dauert mehrere Sekunden. (D) Ein Beispiel für ein EOG in Reaktion auf eine 10-sec anhaltenden Duftstoff Stimulation. Die EOG zeigt Desensibilisierung während der kontinuierlichen Geruchsstoff Präsentation.

Diskussion

Mit dem Setup in diesem Protokoll beschrieben, wird der Duftstoff Reize an der Oberfläche des olfaktorischen Epithels Einklang zwischen Gewebe Vorbereitungen, so dass für den Vergleich zwischen Wildtyp und Mutante Mäuse, obwohl die genaue Odoriermittelkonzentration und Dynamik unbekannt sind. Mehrere Faktoren, insbesondere der Aufnahmeort und die Fließgeschwindigkeit des befeuchtete Luft, zu Schwankungen in der EOG. Es sollte darauf geachtet, von ähnlichen Positionen auf der gleichen Nasenmuschel Datensatz Variation zu minimieren. Dies kann leicht durch die konsequente Aufnahme von der gleichen Seite des Kopfes und halten den Fußabdruck des Mikroskops, Geruch Zuführungsrohr und Mikromanipulatoren auf dem Luft-Tabelle unverändert zwischen Gewebeproben erreicht werden. Darüber hinaus sollten Gewebeproben sofort in die befeuchtete Luftstrom untergebracht werden nach der Sektion Austrocknung des Gewebes zu verhindern.

EOG-Aufnahmen an Mäusen kann auch mit einer Flüssigkeit Perfusionsapparatur auf präparierten Maus durchgeführt werden Nasenmuscheln ^{7, 14, 15,} oder indem man den Kopf intakt und das Einsetzen der Elektrode in ein kleines Loch über dem Nasenmuscheln ^{16, 17} gebohrt. Jede Veränderung der EOG Aufnahme hat seine eigenen Stärken: Luft-Phasen-Aufnahmen auf Gewebe Zubereitungen, die als in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren erfordern ein Minimum an Setup und sind am einfachsten zu führen; Aufnahmen mit einer Flüssigkeit Perfusionsapparatur erleichtern den Einsatz von pharmakologischen Reagenzien, obwohl die hydrophoben Charakter vieler Geruchsstoffe erschwert Geruch Lieferung; schließlich Aufnahmen, in denen der Kopf bleibt intakt ist, kann in "künstliche schnüffeln 'Experimente verwendet werden, obwohl die Platzierung der Elektroden ist schwieriger, als wenn die Nasenmuscheln sind voll ausgesetzt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Luftzufuhrschlauchausrüstung		nach Maß		Der Zylinder einer 1-ml-Spritze mit einer T-Verschraubung kann als Ersatz verwendet werden
Lufttischausrüstung		Newport Corp.	LW3030B-OPT-Verstärker
		Warner Instruments	DP-301
Computer- und Datenerfassungssoftware	Axograph	4.9.2 auf Apple Macintosh		Aktualisierte Versionen von Axograph für Mac OS X und Windows sind ab http://axographx.com/ verfügbar.
	Butanbrenner-Ausrüstung			A crè me brû Lè e Taschenlampe funktioniert gut
Digitizer-Ausrüstung		Axon Instruments	Digidata 1322A
Dissektions-Ausrüstung	Scienscope	SSZ
Elektrodenhalter-Ausrüstung		Harvard Apparatur	64-1021
Magnetische Haltevorrichtungen (12 mm)	Ausrüstung	World Precision Instruments, Inc.	M10
Mikromanipulatoren	Ausrüstung	World Precision Instruments, Inc.	M3301R M3301L
Mikropipettenabzieher	Ausrüstung	Sutter Instrument Co.	P2000
Oszilloskop-Ausrüstung		Tektronix, Inc.	5110
Picospritzer III	Ausrüstung	Parker Hannifin Corporation
Silikonschlauchausrüstung		Nalge Nunc international
Probenbühnenausrüstung	nach Maß			Jeder kleine feste Gegenstand kann verwendet werden, um die Montageschale anzuheben. Die Schale mit Modelliermasse ruhigstellen.
18 Gauge Nadeln	Material	BD Biosciences	305195
2 oz. Glasflaschen	Material	VWR international	16152-201
Glaskapillaren	Material	World Precision Instruments, Inc.	TW150F-6
Silikonstopfen Größe 16D	Material	Chemware	D1069809
Silberdraht	Material	World Precision Instruments, Inc.
SylGuard 184	Material	Dow Corning	SYLG184	Von World Precision Instruments
Agarose-Reagenz		Invitrogen	15510-027
Amylacetat-Reagenz		Aldrich	W504009
Calciumchlorid (CaCl2)	Reagenz	Sigma-Aldrich	C-1016
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Reagenz	Sigma-Aldrich	D5879
HEPES	Reagenz	Fisher Scientific	BP310
Heptaldehyd-Reagenz		Aldrich	H2120
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2+6H2O)	Reagenz	Sigma-Aldrich	M9272
Natriumchlorid (NaCl)	Reagenz	JT Baker	3624-05
Durchflussmessgerät		Gilmont Instruments	GF-2260