Summary
De electroolfactogram (EOG), de opname is een informatieve, gemakkelijk te voeren, en betrouwbare manier te beoordelen olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel. Dit protocol beschrijft een recording setup, muis weefsel voorbereiding, het verzamelen van gegevens, en de elementaire data-analyse.
Abstract
Dieren zijn afhankelijk van reukzin voor vele kritieke gedragingen, zoals het vinden van voedsel bronnen, het vermijden van roofdieren, en het identificeren van soortgenoten om te paren en andere sociale interacties. De electroolfactogram (EOG), de opname is een informatief, makkelijk uit te voeren, en betrouwbare methode voor het testen van olfactorische functie op het niveau van het reukepitheel. Sinds de 1956 beschrijving van het EOG door Ottoson in kikkers 1, heeft de EOG opname is toegepast in veel gewervelde dieren waaronder salamanders, konijnen, ratten, muizen en mensen (beoordeeld door Scott en Scott-Johnson, 2002, ref. 2). De recente ontwikkelingen in genetische modificatie bij muizen hebben weer interesse in het opnemen van de EOG voor de fysiologische karakterisatie van olfactorische functie in knock-out en knock-in muizen. EOG opnames zijn met succes toegepast op de centrale rol van olfactorische signaaltransductie componenten 3-8 aan te tonen, en meer recent de bijdrage van bepaalde regulerende mechanismen 9-12 te karakteriseren OSN reacties.
Geurstof detectie plaatsvindt aan het oppervlak van het reukepitheel op de trilharen van OSNs, waar een signaaltransductie cascade leidt tot het openen van de ionkanalen, het genereren van een stroom die uitmondt in de trilhaartjes en depolariseert het membraan 13. Het EOG is de negatieve potentieel extracellulair opgenomen in het oppervlak van het reukepitheel op geurstof stimulatie, als gevolg van een opsomming van de mogelijke wijzigingen veroorzaakt door individuele reageren OSNs in de opname veld 2. Vergelijking van de amplitude en de kinetiek van de EOG dus waardevolle informatie over hoe genetische modificatie en andere experimentele manipulaties van invloed op de moleculaire signalering ten grondslag liggen aan de OSN reactie op de geur.
Hier beschrijven we een air-fase EOG opname op een voorbereiding van de muis olfactorische neusschelpen. In het kort, na het opofferen van de muis, de olfactorische neusschelpen blootgesteld door halverend het hoofd over de middellijn en het verwijderen van het septum. De turbinate voorbereiding is dan geplaatst in de opname setup, en een registratie-elektrode wordt geplaatst aan het oppervlak van het reukepitheel op een van de mediale neusschelpen. Een referentie-elektrode is elektrisch verbonden met het weefsel door middel van een bufferoplossing. Een continue stroom van bevochtigde lucht wordt geblazen over het oppervlak van het epitheel om het vochtig te houden. De damp van geurende oplossingen wordt opgeblazen in de stroom van bevochtigde lucht aan het epitheel te stimuleren. Reacties worden geregistreerd en gedigitaliseerd voor verdere analyse.
Protocol
Deel 1. Het EOG recording setup
De opname apparatuur bestaat uit een registratie-elektrode, referentie-elektrode, luchttoevoer buis, monster stadium, en ontleden microscoop, allemaal verankerd is op een lucht-tafel in een kooi van Faraday. Micromanipulators worden gebruikt voor de plaatsing van de elektroden en de luchttoevoer buis. Een continue luchtstroom wordt geleid door gedestilleerd water om de luchtvochtigheid toe te voegen voordat die door de lucht levering buis en over het monster. Een 60 mm cultuur schaal gevuld met Sylgard tot een diepte van 6-8 mm wordt gebruikt als een montagevlak voor het monster. Een goed en een kanaal zijn uitgeholde van de Sylgard in de montage van schotel naar een middel te verschaffen om de referentie-elektrode elektrisch verbinden met het model via de oplossing aangepast Ringer's.
De opname elektrode en de referentie-elektrode zijn aangesloten op een versterker. Signalen van de versterker worden verzonden naar een digitizer en vervolgens naar een computer. Software zoals Axograph of pClamp kan gebruikt worden om de stimulatie protocol controle, om het signaal, en voor de daaropvolgende analyse van de antwoorden. Een oscilloscoop aangesloten na de versterker kan handig zijn voor real time monitoring van de elektrische potentiaal, terwijl het plaatsen van de registratie-elektrode en tijdens EOG opnamen.
De levering van odorant stimuli wordt gecontroleerd door een Picospritzer, die is aangesloten op dezelfde computer wordt gebruikt voor het signaal acquisitie. De luchtdruk op de Picospritzer is ingesteld op 10 psi. Een enkele luchttank en regelaar kan worden gebruikt om de lucht te leveren aan zowel de lucht-tafel en de Picospritzer. Een tweede luchttank en regulator wordt gebruikt om de lucht zorgen voor de bevochtigde lucht stroom, want dit vraagt om een lagere druk en een grote hoeveelheid lucht. Net voor het leveren van een geurstof stimulus, wordt de Picospritzer uitgang aangesloten op een geurstof fles. De geurstof fles is dan verbonden met de luchttoevoer buis.
Deel 2: Voorbereiding elektroden
De registratie-elektrode is een chlorided zilverdraad in een getrokken glazen capillaire gevuld met aangepaste oplossing Ringer's (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,4, filter gesteriliseerd). De referentie-elektrode is een chlorided zilverdraad.
- Installeer zilveren draad in de elektrode houder. Voor de registratie-elektrode, moeten een tot twee centimeter van de draad steken van het einde van de elektrode houder. Meer draad kan worden gelaten voor de referentie-elektrode.
- Om de AgCl vacht toe te voegen aan de zilveren draad, de positie van de draad in 0,1 M NaCl en sluit de elektrode houder met de positieve pool van een 1,5-9 V DC voeding. De negatieve pool van de stroombron moet elektrisch worden aangesloten op de 0,1 M NaCl-oplossing. Laat de chloriding reactie te laten verlopen gedurende 10 minuten. Om gelijk een statische lading tussen de opname en de referentie-elektrode, kort samen Raak de elektroden voordat u ze op de opname apparaat.
- Trek een glazen capillaire met behulp van een micropipet trekker. De opening aan het uiteinde van het capillair moet worden rond de 5-10 micrometer in diameter.
- Gebruik een diamant potlood om te scoren en af te breken de stompe einde van de capillaire dus het is ~ 2 cm langer dan de zilveren draad. Fire-polish het afgesneden uiteinde met de butaan toorts.
- Smelt 0,5% agarose-oplossing in gewijzigde Ringer's. Trek een kleine hoeveelheid gesmolten agarose oplossing in de punt van de elektrode met behulp van een overdracht pipet.
- Vul de getrokken capillaire ongeveer 1 / 2 van de manier waarop met de oplossing aangepaste Ringer's (een spuit die is verwarmd en trok een lange dunne uiteinde hebben, is nuttig voor dit doel). Tik zachtjes tegen de capillaire om eventuele luchtbellen te verwijderen. Bewaar de gevulde elektrode in de opslag pot met een kleine hoeveelheid van de oplossing aangepast Ringer's in de bodem tot ze klaar zijn om gebruikt te worden. Zodra een weefselmonster is voorbereid en klaar voor opname, installeer dan een gevulde capillaire over de registratie-elektrode draad.
Deel 3: Voorbereiden van geurstof oplossingen
De geurstoffen amylacetaat en heptaldehyde roepen grote antwoorden en zijn dus goede keuzes als EOG stimulerende middelen.
- In microcentrifuge buizen, bereiden een reeks van verdunningen van de geurende in dimethylsulfoxide (DMSO). Als uitgangspunt voor een dosis-respons curve, bereiden 10-voudige verdunningen van 5 M tot 5 x 10 -6 M. Het maken van verse verdunningen elke dag.
- Verdun de geurstoffen 50-voudig in het water door het mengen van 100 ul verdund in DMSO voorraad met 4,9 ml water in twee ounce flessen met siliconen stoppen. Laat de oplossingen in de flessen equilibreren voor ten minste 30 minuten. Merk op dat de damp concentratie van geurstoffen in elke fles is onbekend, maar zal variëren in functie van de concentratie van geurstoffen in de vloeibare fase.
- Plaats twee 18-gauge naalden door het silicium stop op provide ingang en-uitgang. De poorten moet worden aangesloten wanneer de fles niet in gebruik is.
Deel 4: Opname van de EOG en analyseren van gegevens
- Offer een muis door CO 2 euthanasie of verdoving overdosis gevolgd door onthoofding. Verwijder de huid bovenliggende de schedel en sagittally het hoofd halveren over de middellijn.
- Mount de ene helft van het hoofd, mediale zijde naar boven, op de montage schotel. Verwijder voorzichtig het septum naar de neusschelpen bloot te leggen.
- Zet de schaal met gemonteerde weefsel op de opname podium. Lijn het podium, zodat de opname locatie op de neusschelpen wordt gecentreerd onder de microscoop.
- Zet de luchttank aan bevochtigde lucht te leveren aan de turbinate oppervlak. Plaats de luchttoevoer buis zodanig dat het ongeveer 10 mm afstand van de opnamelocatie. Het debiet is ~ 600 ml / min.
- Zet de versterker aan DC-modus (AC versterking zal artefacten te induceren in de EOG signaal) met een low-pass filter bij 1 kHz, en krijgen bij 100x.
- Mount opnemen en referentie-elektroden op de micromanipulators.
- Laat de referentie-elektrode in de goed op de montage van schotel en bedek met de oplossing aangepast Ringer's zodanig dat het elektrisch verbonden is met het weefsel.
- Voorzichtig lager de registratie-elektrode op het oppervlak van turbinate IIb of III. De elektrode moet nauwelijks Raak het oppervlak van het reukepitheel! Wanneer de elektrode in contact komt met het epitheel (dat wil zeggen vult een elektrisch circuit), een rechte basislijn zal verschijnen in de oscilloscoop.
- Bevestig een geurstof fles aan de zijkant-poort op de luchttoevoer buis.
- Op de computer, start u een stimulatie protocol. De bemonsteringsfrequentie voor data-acquisitie moet 2 kHz of hoger zijn. De software zal leiden tot een geur puls en beginnen met opnemen.
- Een typische stimulatie protocol kan een 100-ms duur van enkele puls, gepaarde 100 msec pulsen gescheiden door een 1-sec interval, of een 10-sec aanhoudende puls worden.
- Laat enige tijd tussen protocollen, zodat het weefsel minimaal is aangepast. Een minuut is voldoende voor vloeibare concentraties van amylacetaat en heptaldehyde tot 10 3 M, bij hogere concentraties laat 5 minuten. Na het leveren van hoge geurconcentraties (zoals aan het einde van een dosis-respons curve) resterende geur kan blijven in de buis. Was de luchtslang met 95% ethanol en droog voordat u verder gaat met extra weefselmonsters.
- Axograph software biedt tools voor het meten van de belangrijkste parameters van de EOG signaal. Dergelijke parameters zijn onder meer de reactie amplitude, latency, tijd om te pieken, en de tijd constanten van beëindiging. Het kan wenselijk zijn om digitaal te sporen filter bij 25 Hz voor verdere analyse.
Representatieve resultaten
Figuur 1. Parameters voor EOG analyse. Verschillende parameters van de EOG zijn bijzonder nuttig voor de respons tussen muizen, waaronder de reactie amplitude, de latency (de tijd tussen het moment dat de prikkel wordt toegediend en de respons begint), stijgen (de tijd tussen de start van de respons en de piek), tijd tot piek (de tijd vanaf het begin van de stimulatie naar de top van de respons), en de tijd constante van beëindiging (τ, bepaald door het aanbrengen van het verval fase van de respons op een exponentiële vergelijking ). Ter vergelijking van de kinetische parameters zoals latency, stijgen de tijd, en tijd constante van de beëindiging, is het raadzaam om de piek amplitude van de reacties te normaliseren voorafgaand aan de analyse.
Figuur 2. Vertegenwoordiger EOG signalen onder verschillende stimulatie protocollen. (A) Voorbeelden van EOGs van een muis in reactie op de stimulatie met toenemende concentraties van amylacetaat. De zwarte lijn aan de bovenkant van het paneel geeft de timing en duur van de geurende stimulatie. De concentraties in de legenda zijn de concentraties van de vloeibare oplossing. (B) Een dosis-respons relatie gemiddeld uit vijf muizen. Error bars zijn 95% betrouwbaarheidsintervallen. Een daling van de piek amplitude wordt vaak waargenomen bij zeer hoge concentraties geur. (C) Een voorbeeld van een EOG in reactie op een gepaarde-pulse stimulatie. Een korte puls van geurende ontlokt aanpassing voor de duur van enkele seconden. (D) Een voorbeeld van een EOG in reactie op een 10-sec volgehouden odorant stimulatie. Het EOG geeft desensibilisatie bij continu odorant presentatie.
Discussion
Met de instellingen beschreven in dit protocol, zal de geurstof stimuli aan het oppervlak van het reukepitheel in overeenstemming zijn tussen de weefselpreparaten, waardoor vergelijking tussen wild type en mutante muizen, hoewel de exacte odorant concentratie en dynamiek onbekend zijn. Een aantal factoren, met name de opname locatie en het debiet van de bevochtigde lucht, variaties veroorzaken in de EOG. Zorg moeten worden genomen om op te nemen van soortgelijke posities op dezelfde turbinate om de variatie te minimaliseren. Dit kan gemakkelijk worden bereikt door het consequent opnemen van dezelfde kant van het hoofd en houden van de footprint van de microscoop, de geur levering buis, en micromanipulators op de lucht tafel onveranderd tussen weefselmonsters. Daarnaast moeten weefsel onmiddellijk te worden geplaatst in de bevochtigde lucht stroom na de sectie te veel uitdrogen van het weefsel te voorkomen.
EOG opnames op muizen kan ook worden uitgevoerd met een vloeistof perfusie apparaat op voorbereid muis neusschelpen 7, 14, 15, of door het verlaten van het hoofd intact en het inbrengen van de elektrode in een klein gaatje geboord boven de neusschelpen 16, 17. Elke variatie van EOG opname heeft zijn eigen sterke punten: air-fase-opnamen op weefselpreparaten zoals beschreven in dit protocol vereisen een minimale hoeveelheid van de installatie en zijn het makkelijkst uit te voeren; opnamen met behulp van een vloeistof perfusie apparatuur te bevorderen van het gebruik van farmacologische reagentia, hoewel de hydrofobe karakter van veel geurstoffen bemoeilijkt geur levering, ten slotte, opnamen waarin het hoofd is intact gelaten kan worden gebruikt in 'kunstmatige snuffelen' experimenten, hoewel plaatsing van de elektroden is moeilijker dan wanneer de neusschelpen zijn volledig blootgesteld.
Disclosures
Muizen werden behandeld en gedood met methoden die door de Animal Care en gebruik comites van de Johns Hopkins University.
Acknowledgments
Wij danken dr. Yijun Song, en leden van de Hattar Kuruvilla Zhao tri-lab van het departement Biologie, Johns Hopkins University voor advies en hulp. Ondersteund door NIH beurzen DC007395 en DC009946.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery tube | equipment | Custom Made | The barrel of a 1-mL syringe with a T-fitting can be used as a substitute | |
| Air table | equipment | Newport Corp. | LW3030B-OPT | |
| Amplifier | equipment | Warner Instruments | DP-301 | |
| Computer and Data Acquisition Software | equipment | Axograph 4.9.2 on Apple Macintosh | Updated versions of Axograph for Mac OS X and Windows are available from http://axographx.com/. | |
| Butane torch | equipment | A crème brûlèe torch works well | ||
| Digitizer | equipment | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Dissecting Scope | equipment | Scienscope | SSZ | |
| Electrode holder | equipment | Harvard Apparatus | 64-1021 | |
| Magnetic Holding Devices (12 mm) | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M10 | |
| Micromanipulators | equipment | World Precision Instruments, Inc. | M3301R M3301L | |
| Micropipette Puller | equipment | Sutter Instrument Co. | P2000 | |
| Oscilloscope | equipment | Tektronix, Inc. | 5110 | |
| Picospritzer III | equipment | Parker Hannifin Corporation | ||
| Silicone tubing | equipment | Nalge Nunc international | ||
| Specimen stage | equipment | Custom Made | Any small solid object can be used to elevate the mounting dish. Immobilize the dish with modeling clay. | |
| 18 gage needles | material | BD Biosciences | 305195 | |
| 2 oz. glass bottles | material | VWR international | 16152-201 | |
| Glass capillaries | material | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-6 | |
| Silicone stoppers size 16D | material | Chemware | D1069809 | |
| Silver wire | material | World Precision Instruments, Inc. | AGW1010 | |
| SylGuard 184 | material | Dow Corning | SYLG184 | From World Precision Instruments |
| Agarose | reagent | Invitrogen | 15510-027 | |
| Amyl acetate | reagent | Aldrich | W504009 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | reagent | Sigma-Aldrich | C-1016 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | reagent | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| HEPES | reagent | Fisher Scientific | BP310 | |
| Heptaldehyde | reagent | Aldrich | H2120 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2+6H2O) | reagent | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Sodium chloride (NaCl) | reagent | JT Baker | 3624-05 | |
| flowmeter | equipment | Gilmont Instruments | GF-2260 |
References
- Ottoson, D. Analysis of the electrical activity of the olfactory epithelium. Acta Physiologica Scandinavica. 35, Suppl 122. 1-83 (1956).
- Scott, J. W., Scott-Johnson, P. E. The electroolfactogram: a review of its history and uses. Microsc Res Tech. 58, 152-160 (2002).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17, 681-693 (1996).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20, 69-81 (1998).
- Zhao, H. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279, 237-242 (1998).
- Wong, S. T. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27, 487-497 (2000).
- Munger, S. D. Central role of the CNGA4 channel subunit in Ca2+-calmodulin-dependent odor adaptation. Science. 294, 2172-2175 (2001).
- Michalakis, S. Loss of CNGB1 protein leads to olfactory dysfunction and subciliary cyclic nucleotide-gated channel trapping. J Biol Chem. 281, 35156-35166 (2006).
- Buiakova, O. I. Olfactory marker protein (OMP) gene deletion causes altered physiological activity of olfactory sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9858-9863 (1996).
- Nickell, W. T., Kleene, N. K., Gesteland, R. C., Kleene, S. J. Neuronal chloride accumulation in olfactory epithelium of mice lacking NKCC1. J Neurophysiol. 95, 2003-2006 (2006).
- Song, Y. Olfactory CNG channel desensitization by Ca2+/CaM via the B1b subunit affects response termination but not sensitivity to recurring stimulation. Neuron. 58, 374-386 (2008).
- Cygnar, K. D., Zhao, H. Phosphodiesterase 1C is dispensable for rapid response termination of olfactory sensory neurons. Nat Neurosci. 12, 454-462 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem Senses. 33, 839-859 (2008).
- Chen, S., Lane, A. P., Bock, R., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Blocking adenylyl cyclase inhibits olfactory generator currents induced by "IP(3)-odors". J Neurophysiol. 84, 575-5780 (2000).
- Pinato, G. Electroolfactogram responses from organotypic cultures of the olfactory epithelium from postnatal mice. Chem Senses. 33, 397-404 (2008).
- Ezeh, P. I., Davis, L. M., Scott, J. W.
- Scott-Johnson, P. E., Blakley, D., Scott, J. W. Effects of air flow on rat electroolfactogram. Chem Senses. 25, 761-768 (2000).
